用于检测非洲猪瘟病毒核酸的荧光PCR引物探针组合及试剂盒制造技术

本申请提供了一种用于检测非洲猪瘟病毒核酸的荧光PCR引物探针组合，并进一步提出了基于上述引物探针组合的试剂盒。利用本申请的引物和探针组合，可重复检测阈值为200Copies/mL，具有较高的灵敏度，且VP72的Ct值稳定在35左右，表明该方法具有较高的稳定性，结果可信度较高，能够快速采样检测，特异性灵敏，价格低廉，具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
用于检测非洲猪瘟病毒核酸的荧光PCR引物探针组合及试剂盒


[0001]本专利技术涉及动物病毒检测
，具体涉及一种用于检测非洲猪瘟病毒核酸的荧光PCR引物探针组合及试剂盒。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟病毒(ASFV)属于非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)、非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)，是该科的唯一已知物种，也是虫媒病毒中唯一的DNA病毒。ASFV二十面体对称，有囊膜，病毒粒子的直径为175～215纳米，其基因组为线性双链DNA，大小在170kb～190kb之间。整个基因组含151～167个开放阅读框架，可以编码150～200种蛋白质，中部为中央保守区(C区)，长度约125kb，基因组两端为可变区，含有末端反转重复序列，可导致不同分离株基因组长度差异。
[0003]非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是一类由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的猪的烈性、高度接触性的传染病，其病死率高达100％。世界动物卫生组织(Office international des epizooties，OIE)将其列为实时申报动物疫病，我国农业部将其列为一类动物疫病。非洲猪瘟病毒(ASFV)于1921年首次在肯尼亚报道，主要流行于非洲地区，临床病症表现为：发烧、皮肤发绀、共济失调和多脏器广泛性出血等。2007年格鲁吉亚报道暴发ASF，随后蔓延至整个高加索及俄罗斯地区，此后ASF传入东欧多个国家和地区。我国于2018年8月在沈阳首次发现该病毒，之后迅速蔓延至全国各地，给我国生猪养殖业带来了毁灭性打击，造成了巨大经济损失和社会影响。
[0004]当前，针对非洲猪瘟的实验室检测手段具有一定的局限性，目前主要检测手段有抗原检测和核酸检测，抗原检测主要包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光抗体试验、免疫层析试纸条等技术。但是抗原检测技术存在一定的弊端，检测结果易出现假阳性，检测灵敏度低于实时荧光定量PCR等手段，精准度不高，且操作复杂，耗时长，不适用于非洲猪瘟病毒的快速检测。
[0005]核酸检测包括PCR、实时荧光定量PCR(Real
‑
time Quantitative PCR，qPCR)等，qPCR特异性好，重复性好、操作简单，快速便捷、灵敏度高，目前广泛应用于基因检测领域。VP72是ASFV主要的衣壳蛋白，占病毒粒子蛋白含量的32％，在不同毒株之间高度保守，非洲猪瘟病毒变异快，有必要重新设计PCR检测方法，针对病毒高度保守序列，设计能更好的应对目前流行的非洲猪瘟病毒的检测方法。

技术实现思路

[0006]专利技术目的：本专利技术的目的之一在于提供具有高度保守的引物序列和探针组合，可以更好应对目前流行的非洲猪瘟病毒的检测。
[0007]本专利技术的目的之二在于提供一种非洲猪瘟荧光PCR快速检测试剂盒，实现非洲猪瘟病毒的快速检测。
[0008]为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种用于检测非洲猪瘟病毒核酸的荧光PCR引物探针组合，包括如下引物对和与引物对配合使用的探针：
[0009]正向引物VP72F为：5
’‑
TTGGGTGCATGTCATTCGTC
‑3’
；(SEQ ID NO：1)
[0010]反向引物VP72R为：5
’‑
GTAAACGGCGCCCTCTAAAG
‑3’
；(SEQ ID NO：2)
[0011]探针(ASFV
‑
P)的核苷酸序列为：5
’‑
AGCTTCAAACGTTTCCTCGC
‑3’
；(SEQ IDNO：3)
[0012]其中，所述探针的核苷酸序列在5
’
端结合有荧光报告基团，3
’
端结合有荧光猝灭基团。
[0013]具体地，所述荧光报告基团为FAM、HEX、TET、JOE、ROX和CY5中的任意一种；所述淬灭荧光基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA和Eclipse中的任意一种。
[0014]优选地，所述荧光报告基团为FAM，所述淬灭荧光基团为BHQ1。
[0015]本专利技术进一步提出了一种用于检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述所述的荧光PCR引物探针组合。
[0016]进一步地，所述试剂盒还包括荧光PCR反应液、DNA聚合酶、阴性对照以及阳性对照中的一种或多种。
[0017]其中，所述阳性对照为pEASY
‑
TI
‑
p72重组质粒；所述阴性对照为ddH2O。
[0018]具体地，本专利技术的ASFV荧光PCR检测试剂包含了除核酸模板外的所有荧光PCR反应组分(见表1)，反应体积为25μl，可配成2
×
(即12.5μl/反应)的预混液保存于
‑
20℃，使用时加ddH2O(无菌超纯水)和待测样本核酸至25μl的反应体积即可上机检测。试剂的反应体积可按比例在10μl
‑
50μl范围内扩大或缩小。
[0019]表1.ASFV荧光PCR检测试剂反应组分
[0020][0021]经过大量实验，优化反应条件，试剂最佳PCR反应体系为：2
×
HyperProbe Mixture12.5μl，100μM/L ASFV
‑
F/ASFV
‑
R各0.05μl，100μM/L ASFV
‑
P 0.05μl，然后加入5μl阳性对照/阴性对照，加ddH2O(无菌超纯水)使体积至25μl。所述试剂盒的PCR反应程序为：
预变性95℃，30s；变性95℃，10s；退火60℃，此处采集荧光信号。
[0022]本专利技术的ASFV荧光PCR检测试剂的反应程序按表2设置，根据探针荧光报告基团设置荧光信号。
[0023]表2.ASFV荧光PCR检测试剂反应程序
[0024][0025]反应后ASFV的检测结果分别根据以下条件进行判定：
[0026]其中，阴性对照品(ddH2O)的Ct≥40或无Ct，且阳性对照的Ct值≤35，为有效结果。否则结果无效，须排除错误因素后重检。
[0027]检测样品Ct≤35，可报告为ASFV阳性
[0028]检测样品35＜Ct＜40，报告为ASFV疑似阳性，需重复实验或通过独立方法进行确定。
[0029]检测样品Ct≥40或无Ct，则报告为ASFV阴性。
[0030]其中，所述荧光PCR反应体系中，正向引物的浓度为0.1μM
‑
0.4μM；反向引物的浓度为0.1μM
‑
0.4μM；探针的浓度为0.05μM
‑
0.4μM，PCR反应程序为：预变性95℃，30s；变性95℃，10s；退火60℃。
[0031]优选地，所述荧光PCR反应体系中，正向引物的浓度为0.2μM；反向引物的浓度为0.2μM；探针的浓度为0本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测非洲猪瘟病毒核酸的荧光PCR引物探针组合，其特征在于，包括如下引物对和与引物对配合使用的探针：正向引物为：5
’‑
TTGGGTGCATGTCATTCGTC
‑3’
；反向引物为：5
’‑
GTAAACGGCGCCCTCTAAAG
‑3’
；探针的核苷酸序列为：5
’‑
AGCTTCAAACGTTTCCTCGC
‑3’
；其中，所述探针的核苷酸序列在5
’
端结合有荧光报告基团，3
’
端结合有荧光猝灭基团。2.根据权利要求1所述的荧光PCR引物探针组合，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM、HEX、TET、JOE、ROX和CY5中的任意一种；所述淬灭荧光基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA和Eclipse中的任意一种。3.根据权利要求2所述的荧光PCR引物探针组合，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM，所述淬灭荧光基团为BHQ1。4.一种用于检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1
‑
3任一项所述的荧光PCR引物探针组合。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：李梦欢，高波，何文龙，庄志华，王春香，
申请(专利权)人：江苏健为诊断科技有限公司，
类型：发明
国别省市：