一种同时检测中东呼吸综合征冠状病毒和西尼罗河病毒的双重荧光PCR检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种同时检测中东呼吸综合征冠状病毒和西尼罗河病毒的双重荧光PCR检测方法及其用途。本发明专利技术提供用于中东呼吸综合征冠状病毒和西尼罗河病毒检测的特异性引物和探针，并建立了中东呼吸综合征冠状病毒和西尼罗河病毒的双重荧光PCR检测方法。本发明专利技术的特异性引物探针和检测方法特异性强、灵敏度高、重复性和稳定性好，为中东呼吸综合征冠状病毒和西尼罗河病毒的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异的临床检测方法。特异的临床检测方法。

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测中东呼吸综合征冠状病毒和西尼罗河病毒的双重荧光PCR检测试剂盒


[0001]本专利技术涉及一种同时检测中东呼吸综合征冠状病毒和西尼罗河病毒的双重荧光PCR检测试剂盒，本专利技术提供用于中东呼吸综合征冠状病毒和西尼罗河病毒检测的特异性引物和探针，并建立了中东呼吸综合征冠状病毒和西尼罗河病毒的双重荧光PCR检测方法。本专利技术的特异性引物探针和检测方法特异性强、灵敏度高、重复性和稳定性好，为中东呼吸综合征冠状病毒和西尼罗河病毒的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异的临床检测方法，属于体外诊断领域。

技术介绍

[0002]中东呼吸综合征冠状病毒（Respiratory Syndrome Coronavirus in the Middle East，MERS）是一种新型的冠状病毒，这种病毒已经被命名为中东呼吸综合症冠状病毒，大多数MERS病毒感染病例发生在沙特。人体内的冠状病毒最早于1960年代在英国被分离出来，病毒因其表面皇冠状的突起物而得名。它可能与人、猪、猫、狗、鼠和鸡的呼吸系统感染相关。2003年中国出现的SARS病毒属于冠状病毒。MERS由此成为第六种已知的人类冠状病毒，也是过去10年里被分离出来的第三种。
[0003]西尼罗河病毒（West Nile Virus）属于黄病毒科黄病毒属，与乙型脑炎、黄热病、丙型肝炎等病毒同属。有囊膜，核酸为单链RNA，具有感染性。西尼罗河病毒是一种脑炎病毒，以鸟类为主要的贮存宿主，马、蚊子和人都可以是它的传染宿主，人的发病时间较鸟类感染时间晚33天左右。所有未接触过西尼罗河病毒的人都是易感者，老年人和免疫力弱者易发病、病死率高。西尼罗河病毒感染的潜伏期一般为3~12天。绝大多数(80%)为隐性感染，不出现任何症状，少数人表现为西尼罗河热，病人出现发热、头疼、肌肉疼痛、恶心、呕吐、皮疹、淋巴结肿大等类似感冒症状，持续3~6天。极少数人(1%)感染后表现为西尼罗河病毒性脑炎、脑膜脑炎和脑膜炎。
[0004]目前，以实时荧光定量PCR技术为基础的核酸诊断方法是国内应用最为广泛的方法之一，该方法的原理主要基于标记不同颜色Taq
‑
Man荧光探针。现有的核酸检测试剂盒大多采用单重探针方法实现靶基因的快速诊断。本专利技术采用双重荧光定量PCR技术，在同一反应体系中加入2条不同颜色标记的荧光探针，可以实现在一管反应中同时检测2个靶基因的目的，能够同时检测中东呼吸综合征冠状病毒和西尼罗河病毒，通量高，检测速度快。在疾病诊断和防治等方面具有重要的应用前景。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种同时检测中东呼吸综合征冠状病毒和西尼罗河病毒的双重荧光PCR检测试剂盒及使用方法，快速准确地检测样品中是否存在中东呼吸综合征冠状病毒和西尼罗河病毒，提供一种特异性检测中东呼吸综合征冠状病毒和西尼罗河病毒的双重荧光PCR试剂盒。
[0006]组分包括PCR反应液、酶混合液、阴性质控品和阳性质控品。其中PCR反应液主要含有上述的2种病毒的引物和探针、反应缓冲液、Mg
2+
和dNTP等，酶混合液主要含有逆转录酶和热启动Taq酶，阴性质控品为无RNase和DNase水，阳性质控品为含有中东呼吸综合征冠状病毒和西尼罗河病毒检测靶序列的重组质粒。
[0007]PCR反应液中用于核酸扩增的引物为P1和P2，P1和P2为针对中东呼吸综合征冠状病毒和西尼罗河病毒基因组群特异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性引物；PCR反应液中用于荧光信号监测的寡核苷酸探针为Probe1，Probe1为针对中东呼吸综合征冠状病毒和西尼罗河病毒基因组群特异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性探针具体引物序列（见表1）。
[0008]表1 引物和探针序列试剂盒选用的PCR反应体系为20
ꢀµ
l，包括2
×
PCR缓冲液10
ꢀµ
l、10mmol/L dNTP 1.0
ꢀµ
l、逆转录酶和热启动Taq酶混合液0.8
ꢀµ
l、混合引物0.35
µ
l、样品RNA 2
µ
l，加灭菌水至终体系20
ꢀµ
l。
[0009]试剂盒的PCR反应循环，逆转录阶段：42℃，10min；预变性阶段：94℃，10sec；预扩增阶段：变性 94℃，5sec；退火 50℃，20sec；延伸 72℃，20sec；共5个循环。注意本阶段不采集荧光信号。检测阶段：变性 94℃，5sec；退火 56℃，50sec；延伸 72℃，15sec；共40个循环。在退火步骤检测荧光信号。
[0010]质量控制：每次实验应设立阴、阳性对照，阴性对照无Ct值（或Ct值为0），阳性对照Ct值≤30，否则实验结果不成立。
[0011]结果判读：阳性：出现“S”型扩增曲线，Ct值≤35；可疑：出现“S”型扩增曲线，但Ct值＞35；阴性：没有出现“S”型扩增曲线，或者曲线虽然超过了阈值，但不呈“S”型；对可疑结果，应重复实验，如果重复实验还是出现“S”型扩增曲线，阴性对照没有污染，可判断为阳性。
[0012]样本要求：临床样本类型包括咽拭子、痰液和细菌培养物；临床样本采集后应带冰运输，
‑
20℃保存，不能反复冻融；从临床样本提取RNA，建议采用性能稳定可靠的商品化试剂盒，具体方法参见相应商品化试剂盒说明书，提取的RNA应立即检测，否则，应将RNA分装后
‑
80℃～
‑
20℃保存。
[0013]本专利技术提供的试剂盒具有很好的特异性，可以检出中东呼吸综合征冠状病毒和西尼罗河病毒，但不能检出非中东呼吸综合征冠状病毒和西尼罗河病毒的核酸；对中东呼吸综合征冠状病毒和西尼罗河病毒核酸的检测下限为10拷贝每反应体系；只需要2小时即可完成检测，可为中东呼吸综合征冠状病毒和西尼罗河病毒的疾病监测和临床诊断提供实验依据。
附图说明
[0014]图1为实时荧光PCR检测中东呼吸综合征冠状病毒阳性标准品的扩增曲线图，图2为实时荧光PCR检测西尼罗河病毒阳性标准品的扩增曲线图。从左至右的每组曲线对应浓度依次为2
×
106‑2×
102copies/μl，试剂盒对中东呼吸综合征冠状病毒和西尼罗河病毒的检测限为10拷贝每反应体系。横坐标为反应循环数，纵坐标为不同循环数荧光检测信号的ΔRn值。
[0015]图3为多重实时荧光PCR检测体系检测10种病毒基因组的扩增曲线图。10种病毒包括：中东呼吸综合征冠状病毒、西尼罗河病毒和8种阴性对照微生物。西尼罗河病毒和中东呼吸综合征冠状病毒出现S型扩增曲线，而其他8种病原微生物未出现S型扩增曲线。
具体实施方式
[0016]下面结合具体实施例详细说明本专利技术的优选实施方式。需要指出的是，这里列出的实施例仅仅为示例性说明的目的，而不应将其解释为对本专利技术范围的任何限制。其中使用的试剂盒、缓冲液等试剂仅仅为该具体实施例中具体选择的试剂，应理解，本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时检测中东呼吸综合征冠状病毒和西尼罗河病毒的引物探针组合，其特征在于，包括中东呼吸综合征冠状病毒和西尼罗河病毒的检测引物探针，具体引物探针序列如下：中东呼吸综合征冠状病毒：SEQ NO.1上游引物P1：5`
‑
TGCTAAGAATAGAGCTCGCACTGTT
‑
3`SEQ NO.2下游引物P2：5`
‑
TAGTACCAATGACGCAAGTCGCT
‑
3`SEQ NO.3探针Probe 1：5`
‑
FAM
‑
TCGCCAGTACCATCAG
‑
MGB
‑
3`西尼罗河病毒：SEQ NO.4上游引物P1：5`
‑
CCTGTGTGAGCTGACAAACTTAGT
‑
3`SEQ NO.5下游引物P2：5`
‑
GCGTTTTAGCATATTGACAGCC
‑
3`SEQ NO.6探针Probe 1：5`
‑
CY5
‑ꢀ
CCTGGTTTCTTAGACATCG
‑
MGB
‑
3`。2.一种同时检测中东呼吸综合征冠状病毒和西尼罗河病毒的双重荧光PCR检测方法，其特征在于，利用权利要求1所述的引物探针混合物对中东呼吸综合征冠状病毒和西尼罗河病毒同时进行检测；中东呼吸综合征冠状病毒和西尼罗河病毒上游引物、下游引物和探针MIX的配比，中东呼吸综合征冠状病毒引物探针MIX，上游引物P1：下游引物P2：探针Probe1=0 .032～0.128：0 .032～0.128：0 .012～0.08；西尼罗河病毒引物探针MIX，上游引物P1：下游引物P2：探针Probe1=0 .032～0.128：0 .032～0.128：0 .012～0.08；0 .012～0.08。3. 根据权利要求2所述的双重荧光PCR检...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁小静，
申请(专利权)人：江苏和创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：