一种猪繁殖与呼吸综合征通用型RT-RAA-LF检测方法技术

本发明专利技术涉及一种猪繁殖与呼吸综合征通用型RT

【技术实现步骤摘要】
一种猪繁殖与呼吸综合征通用型RT
‑
RAA
‑
LF检测方法


[0001]本专利技术涉及了猪繁殖与呼吸综合征检测
，具体的是一种猪繁殖与呼吸综合征通用型RT
‑
RAA
‑
LF检测方法。

技术介绍

[0002]猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是威胁全球养猪业发展的最重要主要疾病之一。PRRSV感染各年龄段的猪，但妊娠母猪和仔猪的临床表现最严重。妊娠母猪感染PRRSV部分会导致流产，胎儿部分自溶和木乃伊胎，而感染PRRSV的幼猪会出现发烧、严重呼吸困难、厌食、嗜睡、眼皮水肿，耳朵或臀部的出现蓝色等典型临床特征。我国于1995年首次报道PRRS，郭宝清团队从PRRS流产胎儿中分离出PRRSVCH
‑
1a毒株(GenbankID：AY032626)，属于PRRSV
‑Ⅱ
。2005年高致病性蓝耳病毒株(Highly pathogenic,HP
‑
PRRSV)的出现导致了非典型的PRRS大流行。自2014年以来，出现新的PRRSV变异NADC30样毒株。到目前为止HP
‑
PRRSV样和NADC30样毒株仍是主要的野生流行毒株，临床检出率较高。
[0003]PRRSV属套式病毒目，动脉炎病毒科，它与马动脉炎病毒(Equine arteritis virus，EVA)、鼠乳酸脱氢酶升高症病毒(Lactate dehydrogenase elevating virus，LDV)和猴出血热病毒(Simian hemmorrhagic fevervieus，SHFV)同属动脉炎病毒属。PRRSV是一种有囊膜的单股正链RNA病毒。它的基因组大小约为15.4kb，5
’
和3
’
端分别有非编码区，包含至少10个开放阅读框(ORF)。
[0004]近年来，PRRSV的流行越来越复杂。因此建立一个快速检测方法为PRRSV的早期防控尤为重要。
[0005]RAA检测技术是基于重组酶介导链置换核酸扩增技术开发的恒温核酸扩增技术，RNA在逆转录酶M
‑
MLV作用下反转成cDNA，DNA/cDNA能够在短时间内(5
‑
20min)扩增109‑
10
12
倍，将RT
‑
RAA产物滴入通用型核酸检测试纸条，扩增产物所带的标记物与试纸条检测线上的抗体结合，在控制线显色后判读结果。阳性标本在试纸上均可观察到检测(T)线和对照(C)线，而阴性结果仅显示一条C线。如果条带上没有显示C线，则结果无效。该技术已成为研究热门，在食品安全检测、人畜病害防治、植物病害诊断等行业广泛应用。
[0006]PRRSV ORF7区域在全病毒基因组中属于高度稳定区，极少出现突变，因此在PRRSV ORF7区域建立一种更加简单、便捷的检测PRRSV的方法，通过与其他检测方法比较，RT
‑
RAA
‑
LF方法具有临床操作便捷、适宜养殖场快速检测使用等特点，适合生猪养殖场推广使用，为PRRSV临床快检检测提供更加高效的途径。

技术实现思路

[0007]为了克服现有技术中的至少部分缺陷，专利技术根据PRRSV研究进展及对PRRSV公开序列进行序列比对及分析，基于基于PRRSV ORF7序列设计一组正反向引物及探针，构建一种基于PRRSV ORF7的RT
‑
RAA
‑
LF检测方法。
[0008]本专利技术涉及的一种用于检测PRRSV的RAA
‑
ORF7型引物和探针，包括RAA
‑
ORF7引物对和RAA
‑
ORF7探针，所述RAA
‑
ORF7引物对的正向引物核苷酸序列为：5'
‑
ATGCCAAATAACAACGGCAAGC
‑
3'，反向引物核苷酸序列为：5'
‑
Biotin
‑
GCAAACTAAACTCCACAGTGTAACTTAT
‑
3'；
[0009]所述RAA
‑
ORF7探针为，
[0010]5'FITC
‑
CAGCCAGTCAATCAGCTGTGCCAAATGCTG(THF)GTAAGATCATCGCC
‑
C3Spacerr
‑
3'，扩增长度为扩增产物长度为292bp。
[0011]本专利技术涉及一种检测PRRSV的RT
‑
RAA
‑
LF扩增试剂，所述的RT
‑
RAA
‑
LF扩增试剂包括上述引物和探针。
[0012]本专利技术涉及一种检测PRRSV的RT
‑
RAA
‑
LF扩增试剂，还包括A Buffer、B Buffer和水。
[0013]本专利技术涉及一种检测PRRSV的RT
‑
RAA
‑
LF扩增试剂在检测PRRSV的应用，其特征在于：包括RT
‑
RAA
‑
LF扩增方法，
[0014]S1、扩增体系51μl：A Buffer40.9μl、正向引物(2μM)2.0μl、反向引物(2μM)2.0μl、探针(2μM)0.6μl、及逆转录酶M
‑
MLV 1μl、RNA样本2.0μl、B Buffer 2.5μl；
[0015]S2、加样操作：先将A Buffer、上下游引物、探针和DEPC处理水以及逆转录酶M
‑
MLV先加入反应干粉Mix，再加入样本震荡混匀，最后在盖上加入BBuffer、与反应管震荡混匀并离心10s；
[0016]S3、扩增条件：将检测单元管放入39℃恒温条件中反应10min，获得扩增产物。
[0017]进一步地，所述步骤S2包括，
[0018]将扩增产物用无菌水5倍稀释待用；
[0019]将以上待用样品加入试纸条缓冲液(HybriDetectAssay Buffer)5倍稀释，试纸条直立插入检测管中检测；
[0020]当试纸条上的控制线显示出条带时立即判读结果。
[0021]进一步地，还包括构建阳性质粒，所述阳性质粒的构建方法包括：
[0022]A1、引物的设计与合成
[0023]A2、RNA提取：
[0024]A2.1、PRRSV(XH
‑
GD株、CH
‑
1a株、GM2株)分别接种Marc
‑
145细胞，25cm2细胞培养瓶培养，72h后加入胰酶消化细胞并收集细胞悬液作为样本，使用通用RNA提取试剂盒提取待测样本基因组；
[0025本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测PRRSV的RT
‑
RAA
‑
LF型引物和探针，包括RAA
‑
ORF7引物对和RAA
‑
ORF7探针，其特征在于，所述RAA
‑
ORF7引物对的正向引物核苷酸序列为：5'
‑
ATGCCAAATAACAACGGCAAGC
‑
3'，反向引物核苷酸序列为：5'
‑
Biotin
‑
GCAAACTAAACTCCACAGTGTAACTTAT
‑
3'，扩增长度为扩增产物长度为292bp；所述RAA
‑
ORF7探针为，5'FITC
‑
CAGCCAGTCAATCAGCTGTGCCAAATGCTG(THF)GTAAGATCATCGCC
‑
C3Spacerr
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3'。2.一种检测PRRSV的RT
‑
RAA
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LF扩增试剂，其特征在于，所述的RT
‑
RAA
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LF扩增试剂包括权利要求1所述的引物和探针。3.根据权利要求2所述的检测PRRSV的RT
‑
RAA
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LF扩增试剂，其特征在于：所述RT
‑
RAA
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LF扩增试剂还包括A Buffer、B Buffer和DEPC处理水。4.根据权利要求2
‑
3任一项所述的检测PRRSV的RT
‑
RAA
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LF扩增试剂在检测PRRSV的应用，其特征在于：使用通用RNA提取试剂盒提取待测样本基因组，提取步骤如下：S1、样本处理及用量S1.1、动物组织新鲜动物组织：取新鲜动物组织50
‑
90mg，加入1ml的无菌生理盐水，充分匀浆后，取100μl转移到1.5ml离心管中；冷冻动物组织：取冷冻动物组织5
‑
10mg，在保持样本冷冻状态的情况下加入400μl RLB，充分匀浆，转步骤1.3；S1.2、培养细胞将细胞连同培养液一起转移至1.5ml离心管中，1000
×
g离心5min，弃上清，多次收集得到所需的细胞数；S1.3、血液、唾液等液态样本血液取100μl置于1.5ml离心管中，血浆、唾液等样本取200μl置于1.5ml离心管中；S1.4拭子样本将1个拭子置于离心管中，加入400μl无菌生理盐水，充分涡旋后取200μl溶液置于1.5ml离心管中；S1.5粪便取粪便样本20
‑
30mg，置于1.5ml离心管中，加入400μl RLB，颠倒混匀，25℃或室温静置5min；加入200μl的无水乙醇，颠倒混匀均匀，此时溶液中可能有核酸析出，将RNA吸附柱置于收集管中，将上述含核酸沉淀的溶液全部转移到RNA吸附柱中，8000rpm离心30s，弃滤液；向RNA吸附柱中加入BWB1400μl，8000rpm离心30s，弃滤液，将RNA吸附柱重新放回收集管中，加入400μl洗涤液WB2，8000rpm离心30s，弃滤液，将RNA吸附柱置于新的RNase
‑
free离心管中；向吸附柱柱膜中央上方小心加入50μl TE，枪头避免接触柱膜，8000rpm离心30s，洗脱液即为RNA溶液。5.根据权利要求4所述的检测PRRSV的RT
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RAA扩增试剂在检测PRRSV的应用，其特征在于，还包括以步骤S1提取的待测样品RNA溶液为模板，以所述RAA
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ORF7引物对作为扩增引物，进行等温扩增；
扩增体系(51μl)：A Buffer 40.9μl、上游引物2.0μl(2μM)、下游引物2.0μl(2μM)、探针0.6μl(2μM)、M
‑
MLV逆转录酶1μl、RNA样本2.0μl、B Buffer 2.5μl；扩增条件：39℃恒温扩增10min；加样操作：先将A Buffer、上下游引物、探针先加入反应干粉Mix，再加入DNA/RNA样本震荡混匀，最后在盖上加入B Buffer、与反应管震荡混匀并离心10s，放入水浴锅中进行扩增；检测结果判定：恒温扩增结束后将RT
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RAA扩增产物用无菌水以及试纸条缓冲液(HybriDetect Assay Buffer)稀释，滴入通用型核酸检测试纸条，阳性标本在试纸上均可观察到试验线T和对照线C，而阴性结果仅显示一条C线，如果条带上没有显示C线，则结果无效。6.根据权利要求5所述的检测PRRSV的RT
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RAA
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LF扩增试剂在检测PRRSV的应用，其特征在于，还包括构建阳性质粒，所述阳性质粒的构建...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹宗喜，马佳镁，刘光亮，陈素贞，张艳，黄春媛，范悦轩，郑佳馨，
申请(专利权)人：海南省农业科学院三亚研究院海南省实验动物研究中心，
类型：发明
国别省市：