【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物基因工程，涉及一种靶向编辑猪hsp90aa1基因的sgrna及其应用，更具体的是一种特异靶向敲除猪hsp90aa1的sgrna。
技术介绍
1、热休克蛋白90（hsp90aa1）在细胞内的表达与病毒感染和复制过程密切相关。许多病毒在其生命周期中利用宿主细胞的机制，其中包括借助hsp90aa1的调控来促进病毒复制、传播和逃避宿主免疫应答。许多病毒依赖于hsp90aa1来确保其复制相关蛋白的正确折叠和稳定。
2、通过与病毒蛋白相互作用，促进病毒复制过程中的正确蛋白折叠。此过程对于病毒基因组的复制、装配和释放至关重要。hsp90aa1也在免疫调节中发挥关键作用，通过与病毒感染相关的抗原相互作用，激发宿主免疫系统的反应。这一机制不仅涉及免疫细胞的活化，还可能影响病毒逃避免疫监测的能力。大量研究表明：一些病毒通过调控hsp90aa1来逃避宿主细胞的免疫识别。病毒可以利用hsp90aa1来防止其抗原在细胞表面的展示，从而减轻免疫系统的监测。这种逃避机制使病毒更容易在宿主细胞内复制和传播。
3、鉴于hsp90aa1在病毒复制中的关键作用，其成为潜在的抗病毒治疗靶点备受关注。通过干预hsp90aa1的功能，特别是通过基因敲除技术，可能有望阻断病毒复制的关键步骤，提供新的治疗策略和研究工具。这为利用猪st细胞模型来探究病毒复制与hsp90aa1之间关系提供了新的研究途径。本专利技术提供了一种高效、特异性的基因编辑工具，为猪基因编辑技术的进步和相关研究提供了新的方向。通过hsp90aa1基因的精准敲除，不仅
技术实现思路
1、本专利技术提供一种特异性设计的sgrna，其核苷酸序列与猪hsp90aa1基因的特定区域相匹配。该sgrna的设计经过优化，以确保高效与cas9蛋白结合，形成一种有效的基因编辑工具。通过分子生物学技术，该sgrna可以经合成、纯化，以用于后续的基因敲除实验。
2、所述sgrna1的dna序列的正义链如seq id no：1，其对应互补链的dna序列如seqid n0：2；所述sgrna2的dna序列的正义链如seq id no：3，其对应互补链的dna序列如seqid no：4.
3、本专利技术通过将合成的sgrna导入猪st细胞，并结合cas9蛋白，实现对hsp90aa1基因的高效、精准敲除。该过程经过严格的实验设计和优化，以确保敲除效果稳定可靠。通过qpcr方法，可以验证hsp90aa1基因在猪st细胞中的敲除效果。
4、本专利技术一对敲除猪hsp90aa1基因的sgrna序列，靶向hsp90aa1基因的第二外显子区域，靶序列为cgcgtcccactacacgtgtg和ggaaccatgctagcggttcag，具有较高的靶向效率和敲除效率。所述敲除基于crispr/cas9系统进行，所述sgrna序列包括sgrna1和sgrna2，敲除后hsp90aa1基因表达被抑制；所述sgrna1的dna序列的正义链如seq id no：1，其对应互补链的dna序列如seq id no：2；所述sgrna2的dna序列的正义链如seq id no：3，其对应互补链的dna序列如seq id no：4。
5、本专利技术还提供一种生物材料，所述生物材料包括上述的特异性靶向敲除猪hsp90aa1基因的两条sgrna，所述生物材料为载体或转基因细胞。
6、本专利技术还提供一种敲除载体，可使猪hsp90aa1基因表达被抑制，由上述sgrna 1和sgrna 2的双链dna与载体连接得到。所述载体为px459载体。所述crispr/cas9系统的敲除载体的制备方法，其包括：合成所述sgrna1的dna序列的正义链如seq id no：1，其对应互补链的dna序列如seq id no：2；所述sgrna2的dna序列的正义链如seq id no：3，其对应互补链的dn a序列如seq id no：4，再将单链dna序列经过退火合成双链dna后，连接到px459载体骨架的bbsi酶切位点形成完整的靶向质粒。
7、本专利技术还提供上述sgrna序列在制备hsp90aa1基因表达被抑制的细胞系中的应用；所述细胞系为猪st细胞系。所述猪st细胞系的构建方法：将含有所述特异性靶向猪hsp90aa1基因的sgrna的crispr/cas9基因敲除载体导入细胞，敲除hsp90aa1基因。将所述crispr/cas9基因敲除载体导入细胞可通过电转染等常规生物学方法实现。
8、本专利技术以一对能特异识别猪hsp90aa1基因的sgrna为前提，利用crispr/cas9技术，成功地在猪st细胞系中敲除了hsp90aa1基因。又经过试验验证：本专利技术的hsp90aa1基因敲除细胞系能够在一定程度上抑制猪腹泻病毒在细胞中的增殖，对于抗猪源病毒药物的研究及抗病毒靶点的筛选具有重要意义。本专利技术提供的hsp90aa1基因的敲除方法具有很强的实用性，为 hsp90aa1基因的功能研究及其应用提供了有效方法和基础。
9、表1. sgrna信息
10、 名称 序列（5’-3’） hsp90aa1-sgrna 1-f caccgagaccggaccctcacgatag hsp90aa1-sgrna 1-r aaacctatcgtgagggtccggtctc hsp90aa1-sgrna 2-f caccgcttggtacgatcgccaagtc hsp90aa1-sgrna 2-r aaacgacttggcgatcgtaccaagc
11、本专利技术的有益效果是：
12、本专利技术的sgrna的核苷酸序列特异性设计，能够与cas9蛋白高效结合，实现在猪st细胞中对hsp90aa1基因的精准敲除，抑制hsp90aa1基因的表达。
13、通过本专利技术的技术，研究者能够深入了解hsp90aa1在猪st细胞中的功能、其在细胞应激和病毒复制中的作用，以及潜在的抗病毒治疗靶点。
14、本专利技术不仅提供了一种高效、可行的基因编辑工具，而且为猪基因编辑、生物医学研究等领域的进展提供了新的方向。通过对猪st细胞中hsp90aa1基因的敲本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种靶向编辑HSP90AA1基因的sgRNA，包括HSP90AA1-sgRNA1和HSP90AA1-sgRNA2，其特征在于：
2.一种生物材料，所述生物材料含有上述权利要求1所述的特异性靶向编辑HSP90AA1基因的两条sgRNA，所述生物材料为载体或转基因细胞。
3.一种靶向编辑HSP90AA1基因的sgRNA的表达载体，其特征在于，包含编码权利要求1所述的sgRNA的序列。
4.一种敲除载体，可使猪HSP90AA1基因表达被抑制，由权利要求1所述的sgRNA 1和sgRNA 2的双链DNA与载体连接得到。
5.根据权利要求4所述的敲除载体，其特征在于，所述载体为PX459载体。
6.权利要求1所述的sgRNA或权利要求2所述的生物材料在选育抗猪腹泻病毒中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种靶向编辑hsp90aa1基因的sgrna，包括hsp90aa1-sgrna1和hsp90aa1-sgrna2，其特征在于：
2.一种生物材料，所述生物材料含有上述权利要求1所述的特异性靶向编辑hsp90aa1基因的两条sgrna，所述生物材料为载体或转基因细胞。
3.一种靶向编辑hsp90aa1基因的sgrna的表达载体，其特征在于，包...
【专利技术属性】
技术研发人员：高帅，刘光亮，晁哲，李新建，曹宗喜，辛文水，
申请(专利权)人：海南省农业科学院三亚研究院海南省实验动物研究中心，
类型：发明
国别省市：
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