胃泌素17的单克隆抗体及其细胞株的制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种胃泌素17的单克隆抗体及其细胞株的制备方法和运用，S1制备抗原：合成胃泌素17多肽，将偶联到BSA载体蛋白上，透析后获得胃泌素17抗原；S2免疫：抗原乳化，免疫小鼠；S3细胞融合：小鼠脾细胞悬液依次与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0和混和10xHAT的胸腺细胞混合；S4将HAT培养基换成HT培养基，ELISA筛选；S5亚克隆：筛选出的阳性克隆用梯度稀释法进行亚克隆，直至筛选出纯合的阳性细胞株；S6腹水制备，收集于离心管中，4℃或

【技术实现步骤摘要】
胃泌素17的单克隆抗体及其细胞株的制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物医学工程
，尤其是涉及一种胃泌素17的单克隆抗体及其细胞株的制备方法和应用。

技术介绍

[0002]胃泌素是一种主要由胃窦和十二指肠的G细胞分泌的胃肠激素，对调节消化道功能和维持其结构完整有重要作用。人体中，95％以上有生物活性的胃泌素是α
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酰胺化胃泌素，主要含两种异构体G
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17和G
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34，其中80％～90％是G
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17。G
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17仅由胃窦部G细胞分泌，因此G
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17是反映胃黏膜损伤情况的重要指标。
[0003]以胃泌素17作为核心指标的人体血清胃功能检测，属于一项无创、无痛且安全、经济的人体胃病常用检测方法。这种检测项目可以有效地减少胃癌患病风险，大幅度地提高胃癌疾病的早诊以及早治概率，对于各种胃病的预防和治疗都具有重要的积极意义。当人体内胃泌素17处于低值状态时，通常提示患者的胃部存在一些高酸的状况。而当胃泌素17处于高值状态时，则提示患者的胃内部存在一些炎症，患者可能表现出一些高胃泌素血症的发病症状。这种情况可能跟幽门螺旋杆菌感染、胃溃疡以及药物影响有关系。另外，胃泌素17的变化与患者的胃部受到饮食刺激以及患上其他疾病也有一定的联系。
[0004]免疫分析技术是利用微量抗原与相应的高特异性抗体之间的免疫反应，来检测如激素、药物、蛋白质、多肽、酶、肿瘤相关抗原、微生素、病毒、细菌及金属元素等生物体内活性物质。免疫分析技术包括标记免疫分析、非标记免疫分析和仪器免疫分析。
[0005]荧光免疫分析(FIA)和放射免疫分析(RIA)自问世以来，经历了几十年的发展，但是人们越来越感觉到FIA因自然本地太高，干扰检测结果；RIA采用同位素标记，对人体有极大危害并给实验带来不便。酶免疫分析(EIA)也因酶本身不稳定，受其他影响因素较大，推广应用受到限制。80年代初，人们开始研究用稀土元素代替荧光物质和同位素标记蛋白质或抗体，将时间分辨技术引入到生物检测领域，建立了新型的时间分辨荧光免疫分析技术。该技术采用多学科先进技术，集结了其他免疫分析的特点，在免疫学、分子生物学、细胞学和医学等领域，取得长足的发展和广泛应用。但目前仍存在一些问题：
[0006]1)目前胃泌素17的检验在临床上使用越来越广泛，市场上的免疫法检测用抗体一般以来进口，价格昂贵，供货周期长且不稳定。
[0007]2)目前临床上检测胃泌素17的常用方法为酶联免疫法(Elisa)，加入样本经过一个小时的孵育，然后洗板，加底物，半个小时避光反应后加终止液即完成反应部分，然后读数。由数值来判断结果的浓度值。该方法操作步骤繁琐，检测时间长。
[0008]3)化学发光法是新兴发展起来的检测胃泌素17的方法，该方法需要大型的专业设备，价格昂贵，操作较复杂，不适用于基层医院。

技术实现思路

[0009]本专利技术要解决的技术问题是提供一种胃泌素17的单克隆抗体及其细胞株的制备
方法，将一种胃泌素17多肽与载体蛋白进行偶联反应，得到胃泌素17抗原，所得抗原免疫小鼠制备单克隆抗体，所得抗体运用到免疫层析技术上，具有高灵敏度、高特异性、简单快捷和无需大型仪器设备等优点，可用于胃泌素17的检测。
[0010]为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是，该胃泌素17的单克隆抗体及其细胞株的制备方法，包括以下步骤：
[0011]S1制备抗原：合成胃泌素17多肽，再将胃泌素17多肽偶联到BSA载体蛋白上，透析后获得胃泌素17抗原；
[0012]S2免疫：将步骤S1中制得的胃泌素17抗原进行乳化，免疫雌性小鼠；
[0013]S3细胞融合：无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，依次与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0和混合10xHAT的胸腺细胞混合，然后均匀的分装到若干块铺有饲养细胞的孔板中，放入37℃的5％CO2培养箱中培养；
[0014]S4酶联免疫吸附剂测定ELISA筛选阳性杂交瘤细胞：将HAT培养基换成HT培养基，取上清蛋白进行分别ELISA筛选；具体为：7天后将HAT培养基换成HT培养基，1天后取100μL上清蛋白分别ELISA筛选；
[0015]S5亚克隆：筛选出的阳性克隆用梯度稀释法进行亚克隆，直至筛选出纯合的阳性细胞株；
[0016]S6腹水制备：将对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起，其计数约106个/mL，对小鼠腹腔注射悬浮的细胞，7天后开始收集腹水；取出的腹水于4℃离心，吸出中间的腹水，收集于离心管中，4℃或
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20℃保存；
[0017]S7单克隆抗体的纯化：用HiTrap rProtein A FF(GE公司)亲和层析法从腹水中纯化抗体，纯化后的抗体保存于
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20℃；SDS
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PAGE胶鉴定纯度，Bradford法测定浓度；
[0018]S8双抗夹心法筛选抗体配对：将一株抗体包被在酶标板上，清洗封闭后加入样本在37℃温度下反应70～100min，清洗后加入HRP标记的二抗在37℃进行孵育20～40min，显色终止后读数，筛选出一对抗体2C5和8B10。
[0019]采用上述技术方案，将一种胃泌素17与载体蛋白进行偶联反应，得到胃泌素17抗原，所得抗原免疫小鼠制备单克隆抗体，制备了一对胃泌素17单克隆抗体，将所得抗体运用到免疫层析技术上，具有高灵敏度、高特异性、简单快捷和无需大型仪器设备等优点，可用于胃泌素17的检测。
[0020]作为本专利技术的进一步改进在于，所述步骤S1中的胃泌素17多肽的序列为SEQ ID NO:1。SEQ ID NO:1：
[0021]pGlu
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Gly
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Pro
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Trp
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Leu
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Glu
‑
Glu
‑
Glu
‑
Glu
‑
Glu
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Ala
‑
Tyr
‑
Gly
‑
Trp
‑
Met
‑
Asp
‑
Phe
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Cys。
[0022]作为本专利技术的进一步改进在于，所述步骤S2进行乳化的具体步骤为：
[0023]S21：将步骤S1中制得的胃泌素17抗原与弗氏完全佐剂(Sigma公司)进行混合乳化，即抗原与弗氏完全佐剂按1：1的比例混合；
[0024]S22：选免疫4～6周龄雌性Balb/c小鼠，腹部皮下注射每只小鼠5点，剂量为100μg/只，进行第一次免疫；
[0025]S23：每14天给每只小鼠进行加强免疫一次，每次加强免疫的剂量为50μg/只；
[0026]S24：在第三次加强免疫后的第7天以间接ELISA波长450nm检测小鼠血清中抗免疫
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种胃泌素17的单克隆抗体及其细胞株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1制备抗原：合成胃泌素17多肽，再将胃泌素17多肽偶联到BSA载体蛋白上，透析后获得胃泌素17抗原；S2免疫：将步骤S1中制得的胃泌素17抗原进行乳化，免疫雌性小鼠；S3细胞融合：无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，依次与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0和混合10xHAT的胸腺细胞混合，然后均匀的分装到若干块铺有饲养细胞的孔板中，放入37℃的5％CO2培养箱中培养；S4酶联免疫吸附剂测定ELISA筛选阳性杂交瘤细胞：将HAT培养基换成HT培养基，取上清蛋白进行分别ELISA筛选；S5亚克隆：筛选出的阳性克隆用梯度稀释法进行亚克隆，直至筛选出纯合的阳性细胞株；S6腹水制备：将对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起，其计数约106个/mL，对小鼠腹腔注射悬浮的细胞，7天后开始收集腹水；取出的腹水于4℃离心，吸出中间的腹水，收集于离心管中，4℃或
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20℃保存；S7单克隆抗体的纯化：用HiTrap rProtein A FF亲和层析法从腹水中纯化抗体，纯化后的抗体保存于
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20℃；S8双抗夹心法筛选抗体配对：将一株抗体包被在酶标板上，清洗封闭后加入样本在37℃温度下反应70～100min，清洗后加入HRP标记的二抗在37℃进行孵育20～40min，显色终止后读数，筛选出一对抗体2C5和8B10。2.根据权利要求1所述的胃泌素17的单克隆抗体及其细胞株的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中的胃泌素17多肽的序列为SEQ ID NO:1。3.根据权利要求1所述的胃泌素17的单克隆抗体及其细胞株的制备方法，其特征在于，所述步骤S2进行乳化的具体步骤为：S21：将步骤S1中制得的胃泌素17抗原与弗氏完全佐剂进行混合乳化，即抗原与弗氏完全佐剂按1：1的比例混合；S22：选免疫4～6周龄雌性Balb/c小鼠，腹部皮下注射每只小鼠5点，剂量为100μg/只，进行第一次免疫；S23：每14天给每只小鼠进行加强免疫一次，每次加强免疫的剂量为50μg/只；S24：在第三次加强免疫后的第7天以间接ELISA检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，将效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，尾静脉注射冲击免疫采用抗原与生理盐水混匀，免疫的剂量为50μg/只，完成免疫。4.根据权利要求1所述的胃泌素17的单克隆抗体及其细胞株的制备方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：许行尚，杰弗瑞，
申请(专利权)人：江苏华控生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：