一种睾酮单克隆抗体的制备及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及一种睾酮单克隆抗体的制备及其应用。本发明专利技术提供了高特异性、高灵敏度的睾酮单克隆抗体，利用该抗体制备的试剂盒能够快速检测血清中的睾酮含量，适用于睾酮激素的免疫学检测。解决了睾酮激素在样本中含量低、检测难度大的问题。检测难度大的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种睾酮单克隆抗体的制备及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种睾酮单克隆抗体的制备及其应用。

技术介绍

[0002]睾酮是人体内主要性激素之一，由睾丸间质细胞产生，由毛细血管或静脉输送至外周，或穿过睾丸肌样细胞浸润产生精子的曲细精管。男性血液循环中，95％的睾酮是由睾丸分泌的，女性的卵巢与肾上腺可分泌少量睾酮，但血液循环中的睾酮大多是由雄烯二酮代谢产生。睾酮含量的测定主要用于男性性早熟、青春期发育迟缓、性腺机能减退、无精症或少精症等男性疾病的辅助诊断。睾酮一般在体内不能储存，通常是被迅速地利用或降解，因此在体内的含量极少，用一般的化学方法难以测定。目前常用的检测方法为液相色谱法或紫外分光光度法，但这两种检测方法步骤繁琐，检测时间长，不能广泛应用于临床的快速诊断。而利用单克隆抗体是解决这个问题的最好途径。
[0003]从免疫文库中筛选小分子睾酮单克隆抗体是较为广泛的方法。在抗体开发过程中，因小分子抗原无免疫原性，因此想要得到明确抗原决定簇的抗体，需偶联载体蛋白后进行动物免疫。噬菌体展示技术是将免疫后的免疫器官中的整套编码抗体基因序列通过分子克隆技术整合到载体上，形成抗体文库，以融合蛋白的形式展现在噬菌体表面，通过多轮的筛选可获得特异性抗体。利用噬菌体展示技术筛选稳定性好、特异性高的睾酮单克隆抗体对于男性疾病的临床诊断具有重要意义。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种睾酮单克隆抗体的制备及其应用。本专利技术提供的单克隆抗体应用于血清样本检测，可快速、特异、灵敏的检测临床血清中睾酮的浓度，可用于临床诊断。
[0005]本专利技术提供的睾酮单克隆抗体，是通过将睾酮衍生物(T
‑3‑
CMO)偶联载体蛋白后进行动物免疫并经过噬菌体展示平台获得的，经测序鉴定其轻链的三个CDR区分别具有如SEQ ID NO:1～3所示的氨基酸序列，其重链的三个CDR区分别具有如SEQ ID NO:4～6所示的氨基酸序列；
[0006]进一步的，所述睾酮单克隆抗体具有如SEQ ID NO:7所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:8所示的重链可变区；
[0007]所述睾酮单克隆抗体还包括轻链恒定区和重链恒定区；所述轻链恒定区为κ型；所述重链恒定区为兔IgG型。
[0008]本专利技术提供的睾酮单克隆抗体优于其他抗体，实验结果表明，本专利技术所述的睾酮单克隆抗体的特异性更好。将所述睾酮单克隆抗体应用到试剂盒中，发现其准确性、灵敏度、稳定性、精密性和回收率性能均优于其他抗体制得的试剂盒和市售试剂盒。
[0009]本专利技术提供了编码所述睾酮单克隆抗体的核酸，具体包括：
[0010]编码所述睾酮单克隆抗体轻链可变区的核酸具有如SEQ ID NO:9所示的序列；
[0011]编码所述睾酮单克隆抗体重链可变区的核酸具有如SEQ ID NO:10所示的序列；或
[0012]与SEQ ID NO:9～10所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与SEQ ID NO:9～10所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列。
[0013]本专利技术中，所述的核酸可以是DNA、RNA、cDNA或PNA。在本专利技术实施例中，所述核酸为DNA形式。所述DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。所述DNA可以是单链的或是双链的。核酸可以包括具有不同功能的核苷酸序列，如编码区和非编码区如调控序列(例如启动子或转录终止子)。所述RNA形式为由基因转录获得的mRNA等。
[0014]本专利技术提供了表达模块，其包括启动子、终止子和本专利技术所述的核酸。
[0015]进一步的，所述的表达模块包括本专利技术所述的核酸以单个或多个串联形式与所述启动子、终止子组成的表达模块，本专利技术对此不做限定。
[0016]本专利技术中还提供了含有所述的核酸或所述的表达模块的转录单元，所述转录单元是指启动子开始至终止子结束的DNA序列。启动子和终止子两侧或之间还可包括调控片段，所述调控片段可以包括与核酸序列可操作地连接的启动子、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、核酸限制性位点、和同源重组位点，例如启动子的增强子，poly(A)信号等。
[0017]本专利技术还提供了重组载体，其包括：
[0018]载体骨架和本专利技术所述的核酸；或
[0019]载体骨架和本专利技术所述的表达模块。
[0020]本专利技术所述的重组载体，是指核酸载体，是一种重组DNA分子，其包含期望的编码序列和对可操作连接的编码基因在具体宿主生物内的表达所必不可少的合适的核酸序列或元件。对细菌中的表达必需的核酸序列或元件包括启动子，核糖体结合位点及可能的其它序列。已知细菌细胞利用启动子，增强子以及终止子。一经转化进入合适的宿主，载体可以独立于宿主基因组进行复制和发挥作用，或者，在一些情况下，自己整合进入基因组。在本说明书中，“质粒”和“载体”有时可以交换通用，因为质粒是当前最普遍使用的载体形式。然而，本专利技术意图包括表达载体的这样的其它形式，其发挥等价作用，其在本领域是已知的或将变为已知的，包括但不限于：质粒，噬菌体颗粒，病毒载体和/或仅为潜在的基因组插入物。
[0021]本专利技术提供了宿主，其包括如下I)～III)所示中的至少一种：
[0022]I)、分泌本专利技术所述的睾酮单克隆抗体；
[0023]II)、基因组整合本专利技术所述的核酸或本专利技术所述的表达模块；
[0024]III)、转染或转化本专利技术所述的重组载体。
[0025]本专利技术中，重组载体转染或转化进入宿主；所述转化的方法包括：化学转化和电转化；所述转染的方法包括磷酸钙共沉淀、人工脂质体法、病毒转染。所述的病毒转染包括腺病毒转染、腺相关病毒转染、慢病毒转染等。
[0026]进一步的，本专利技术所述的宿主包括细菌、真菌、病毒或动物。所述细菌包括革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌；所述革兰氏阳性菌包括但不限于大肠杆菌。所述真菌包括霉菌、酵母、蕈菌；所述酵母包括啤酒酵母、酿酒酵母、毕赤酵母和假丝酵母等。所述病毒包括但不限于包括腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、朊病毒。所述动物包括人、鼠、兔、猪、斑马鱼等。
[0027]本专利技术提供了所述的睾酮单克隆抗体的制备方法，包括培养本专利技术所述的宿主，
获得所述单克隆抗体。
[0028]本专利技术提供了所述睾酮单克隆抗体与介质偶联形成的偶联物。
[0029]具体的，本专利技术所述的睾酮单克隆抗体与介质偶联形成的偶联物，所述介质包括放射性核素、多肽毒素、药物分子或载体。所述多肽毒素包括植物毒素、细菌毒素和动物毒素。所述药物分子包括阿霉素、柔红霉素、平阳霉素、博安霉素、丝裂霉素、新制癌菌素、氨甲喋呤等。所述载体是指任何能够负载单克隆抗体的承载体，例如磁微粒、试纸条、聚苯乙烯平板或酶标板等。
[0030]本专利技术提供了所述睾酮单克隆抗体经化学标记或生物标记形成的复合物。
[0031]具体的，本专利技术所述的睾酮单克隆抗体经化学标记或生物标记本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.睾酮单克隆抗体，其特征在于，其轻链的三个CDR区分别具有如SEQ ID NO:1～3所示的氨基酸序列，其重链的三个CDR区分别具有如SEQ IDNO:4～6所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的睾酮单克隆抗体，其特征在于，其具有如SEQ ID NO:7所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:8所示的重链可变区。3.根据权利要求1或2所述的睾酮单克隆抗体，其特征在于，其轻链恒定区为κ型；其重链恒定区为兔IgG型。4.编码权利要求1～3任一项所述睾酮单克隆抗体的核酸。5.根据权利要求4所述的核酸，其特征在于，编码所述睾酮单克隆抗体轻链可变区的核酸具有如SEQ ID NO:9所示的序列；编码所述睾酮单克隆抗体重链可变区的核酸具有如SEQ ID NO:10所示的序列。6.表达模块，其特征在于，其包括启动子、终止子和权利要求4或5所述的核酸。7.重组载体，其特征在于，包括：载体骨架和权利要求4或5所述的核酸；或载体骨架和权利要求6所述的表达模块。8.宿主，其特征在于，其包括如下I)～III)所示中的至少一种：I)、分泌如权利要求1～3任一项所述睾酮单克隆抗体；II)、基因组整合如权利要求4或5所述的核酸或如权利要求6所述的表达模块；III)、转染或转化如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：李笑颜，周雷鸣，董艳娜，田晓平，赵巧辉，李桂林，付光宇，杨增利，
申请(专利权)人：郑州伊美诺生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：