用于基于蛋白质印迹测定肉毒杆菌毒素效力的基于细胞的方法技术

描述了基于细胞的方法，用于在没有大量实验室动物的LD

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于基于蛋白质印迹测定肉毒杆菌毒素效力的基于细胞的方法
[0001]本公开涉及用于制备包含肉毒杆菌毒素的组合物的肉毒杆菌毒素效力筛选的领域。
[0002]相关申请的交叉引用
[0003]本申请要求于2020年07月10日提交的美国申请号63/050,461的优先权，其通过引用整体并入本文。

技术介绍

[0004]肉毒杆菌神经毒素(BoNT)是一个结构相似但抗原性不同的蛋白质神经毒素家族，其作用于外周神经系统以阻断神经肌肉传递。这些神经毒素的效力极强，人体致死剂量在微克量级时，会导致罕见但是经常致命的疾病，即肉毒杆菌中毒。肉毒杆菌神经毒素的测定目前用于食品和制药行业。食品行业采用肉毒杆菌神经毒素测定来验证新的食品包装方法，并确保食品安全。随着肉毒杆菌毒素越来越多地用于临床，制药行业需要对这些毒素进行准确的测定，以用于产品配方和质量对照。
[0005]已知使用小鼠致死试验来测定食品中的肉毒杆菌毒素。多年来，该试验一直是行业标准，尽管在过去10年中，已经开发了许多免疫测定方法，以试图在大多数应用中取代小鼠试验。
[0006]一种这样的测定方法是通过将试验样品添加到附着有抗体的板或柱中来进行，该抗体与样品中存在的毒素结合。另一种抗体通常用于检测结合的毒素。这些酶联免疫吸附测定法(ELISA)的优点在于，它们对一种肉毒杆菌毒素类型是特异性的，并且可以在不到2小时内快速进行。然而，ELISA有一些缺点：(1)它们没有测量毒素的生物学活性，(2)它们无法区分活性毒素和非活性毒素，以及(3)由于抗原变异，一些毒素没有通过这些测定检测到，因此产生了假阴性。
[0007]已知肉毒杆菌神经毒素在其轻亚基内具有高度特异性的锌内肽酶活性。根据神经毒素的类型，这些作用是切割神经细胞中参与神经递质释放的小蛋白质。肉毒杆菌A型(BoNT/A)、E型(BoNT/E)和C型(BoNT/C)毒素切割蛋白质，SNAP
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25。肉毒杆菌B型、D型、F型和G型和破伤风毒素切割囊泡相关膜蛋白(VAMP
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也称为小突触泡蛋白)。肉毒杆菌型毒素切割蛋白质突触融合蛋白。
[0008]在进一步的毒素测定的开发中，已经设计了各种规程用于评估内肽酶活性。液相色谱规程是已知的，并且基于肽产物的解析和随后的评估。这些规程费时、昂贵，并且不容易自动化。还已知使用分光光度法，需要开发合适的显色肽试剂。此类方法提供了内肽酶的连续精确测定。然而，分光光度法需要相对纯的酶制剂，并且通常不适于评价粗样品或颗粒样品中的内肽酶活性。
[0009]尽管做出了这些努力，但是目前，肉毒杆菌毒素的生物活性的唯一方便的测定是小鼠致死性试验。该试验有许多缺点：(1)它很昂贵并且使用了大量的实验室动物，(2)它是非特异性的，除非与使用特异性抗血清的毒素中和试验平行进行，以及(3)它缺乏准确性，
除非使用大型动物群体。
[0010]显然需要用于确定肉毒杆菌毒素效力的高精度和低复杂性测定法。本公开提供了该需求的答案。

技术实现思路

[0011]本公开通常涉及不必依赖于小鼠的LD
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实验，基于细胞的确定肉毒杆菌神经毒素(BoNT)效力的方法。
[0012]在一些方面，本公开广泛涉及一种确定肉毒杆菌神经毒素(BoNT)效力的方法，所述方法包含：(a)将至少两个不同的BoNT样品分配到至少两个包含表达SNAP25蛋白质的细胞的容器中，其中第一个BoNT样品是已知效力的参照样品，第二个BoNT样品是未知效力的试验样品，(b)将所述细胞与所述BoNT一起孵育一段时间，(c)确定对应于所述参照样品和所述试验样品的切割的SNAP25蛋白质与未切割的SNAP25蛋白质的比率，以及(d)确定所述试验样品相对于所述参照样品的效力。
[0013]在一些方面，将第三个BoNT样品(已知效力的质量对照样品)分配到第三个容器中，并且用作阳性对照。在一些方面，与鼠LD
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测定法相比，所述试验样品的相对效力至少准确95％。在一些方面，(c)包含对所述切割的和未切割的SNAP25蛋白质进行蛋白质印迹和光密度定量。
[0014]在一些方面，所述时间段为至少6、12、16、20、24、32、40、48或56小时。在一些方面，所述至少两个容器各自包含多个孔。在一些方面，所述至少两个不同的BoNT样品在所述多个孔中连续稀释。在一些方面，所述至少两个容器是组织培养板。在一些方面，所述至少两个容器是48、96、384或1536孔板。
[0015]在一些方面，所述细胞黏附或附着于所述至少两个容器。在一些方面，所述细胞天然表达SNAP25。在一些方面，所述细胞表达异源SNAP25。在一些方面，所述细胞是非神经元细胞。在一些方面，所述细胞是基因修饰的。在一些方面，所述细胞是神经元细胞。在一些方面，所述神经元细胞是运动神经元。
[0016]在一些方面，所述细胞用非增殖剂处理。在一些方面，所述非增殖剂抑制γ
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分泌酶。在一些方面，所述非增殖剂是DAPT。在一些方面，在(b)结束后向所述至少两个容器中添加蛋白酶抑制剂。
[0017]在一些方面，将所述细胞与所述BoNT一起孵育后，所述细胞被裂解。在一些方面，所述细胞通过超声处理裂解。在一些方面，所述细胞通过添加裂解剂来裂解。在一些方面，所述裂解剂包含洗涤剂。在一些方面，所述BoNT样品选自BoNT/A、BoNT/E和BoNT/C。
[0018]以下详细描述是示例性的和解释性的，旨在对本专利技术提供进一步解释。
附图说明
[0019]图1描绘了基于细胞的肉毒杆菌毒素效力方法的示例性工作流程。
[0020]图2描绘了运动神经元接种和维持的工作流程。
[0021]图3描绘了将运动神经元放置在用灰色标记的96孔板中。行A和行H以及列1和列12被留空以避免“边缘效应”。
[0022]图4描绘了具有三个细胞板的测定的完整板设置。将每个毒素单元添加到交替的
行中，以避免板偏置。Ref＝参照，QC＝质量对照，Unk＝未知。
[0023]图5描绘了用于蛋白质印迹的工作流程的示意图。
[0024]图6描绘了通过蛋白质印迹获得的图像。TGX蛋白凝胶的所有15个泳道都是可见的。在每个泳道中，检测到两条蛋白质条带：未切割的(上部条带)和切割的(下部条带)SNAP25。图6中描绘的蛋白质凝胶的每一个泳道描述于表A。
[0025]表A.蛋白质凝胶从左到右的15个泳道的描述描绘于图6。
[0026][0027][0028]图7A
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7B描绘了可以用于具有R的DRC分析的3plate.rs脚本。
[0029]图8A
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8B描绘了用于R统计分析的替代代码脚本。
[0030]图9描绘了测量的切割SNAP25的％相对于预期的切割％值的图。左上图：测量的未切割的SNAP25的％与预期的未切割的SNAP25的％，右侧：平均条带体积与未切割的SNAP25本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种确定肉毒杆菌神经毒素(BoNT)效力的方法，所述方法包含：(a)将至少两个不同的BoNT样品分配到至少两个包含表达SNAP25蛋白的细胞的容器中，其中第一个BoNT样品是已知效力的参照样品，并且第二个BoNT样品是未知效力的试验样品，(b)用所述BoNT孵育所述细胞一段时间，(c)确定对应于所述参照样品和所述试验样品的切割的SNAP25蛋白与未切割的SNAP25蛋白的比率，以及(d)鉴定所述试验样品相对于所述参照样品的效力。2.根据权利要求1所述的方法，其中将第三个BoNT样品(已知效力的质量对照样品)分配到第三个容器中，并且用作阳性对照。3.根据权利要求1所述的方法，其中与鼠LD
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测定法相比，所述试验样品的相对效力至少准确95％。4.根据权利要求1所述的方法，其中(c)包含对所述切割的和未切割的SNAP25蛋白质进行蛋白质印迹和光密度定量。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述时间段为至少6、12、16、20、24、32、40、48或56小时。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少两个容器各自包含多个孔。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述至少两个不同的BoNT样品在所述多个孔中连续稀释。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少两个容器是组织培养板。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少两个容...

【专利技术属性】
技术研发人员：E，
申请(专利权)人：高德美控股有限公司，
类型：发明
国别省市：