特异性靶向绒山羊安全位点H11的sgRNA及其应用制造技术

本发明专利技术提供了特异性靶向绒山羊安全位点H11的sgRNA和利用CRISPR/Cas9系统介导完成定点敲除以及定点整合EGFP基因的应用。本发明专利技术首先利用生物信息学方法预测出H11位点的完整序列(SEQIDNO.1)，然后针对H11位点设计了两个sgRNA(SEQIDNO.2和3)，转录所述sgRNA序列的DNA序列如SEQIDNO.4或5所示。构建了基于CRISPR/Cas9系统的打靶载体，然后利用TA克隆测序对sgRNA的引导效率进行验证，同时构建了同源整合EGFP基因载体，最后利用筛选出的sgRNA(Cas9/gRNA共表达载体)和同源整合载体(H11

【技术实现步骤摘要】
特异性靶向绒山羊安全位点H11的sgRNA及其应用


[0001]本专利技术针对“特异性靶向绒山羊安全位点H11的sgRNA及其应用”主要涉及生物信息学和基因工程领域，包括H11位点的预测、sgRNA的设计、CRISPR/Cas9载体的构建、细胞转染、TA克隆测序检测sgRNA的效率、同源整合载体的构建以及阳性细胞的筛选等。
[0002]H11位点，H11位点位于小鼠11号染色体，由Simon Hippenmeyer在2010年发现，位于EIF4ENIF1和DRG1基因之间，不含有启动子，因此，外源基因可以在不影响内源基因的情况下使用特定启动子高效表达。研究人员发现该位点的纯合敲入小鼠可正常发育和繁殖，随后还在猪上对H11位点进行了鉴定和安全性验证，结果显示，与小鼠一样，该位点插入外源基因并不会影响猪的健康生长。
[0003]基因编辑技术是一种对细胞内DNA进行序列特异性修饰的技术，主要包括对DNA片段的插入、删除、替换等。基于编程核酸酶的精确基因组编辑开启了在体外和体内实现所需基因组编辑结果的可能性，并确保其安全、快速地用于跨生物学的基因组工程本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.特异靶向绒山羊安全位点H11的sgRNA，其RNA序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3。2.如权利要求1所述的sgRNA，其特征在于，转录所述sgRNA的DNA序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。3.如权利要求1或2所述的sgRNA，其特征在于，所述绒山羊安全位点H11位于山羊第17染色体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。4.含有权利要求1
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3任一所述sgRNA的CRISPR/Cas9打靶载体，其特征在于，含有荧光标记基因EGFP以及药物筛选标记Puro。5.特异性靶向绒山羊安全位点H11的同源整合载体，其上下游同源臂序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7。6.含有权利要求5任一所述的同源整合载体，其特征在于，上下游同源臂的唯一性。7.权利要求1
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3任一所述的sgRNA或权利要求4
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6所述的CRISPR/Cas9打靶载体和同源整合载体在特异识别和靶向修饰绒山羊安全位点H11中的应用...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘东军，张耀光，高源，郝斐，宋卫国，
申请(专利权)人：内蒙古大学，
类型：发明
国别省市：