用于生物大分子分离纯化的柱切换循环体积排阻色谱系统技术方案

本发明专利技术涉及一种用于生物大分子分离纯化的柱切换循环体积排阻色谱系统，包括：液相色谱泵，进样阀，三通或四通连接头，切换阀Ａ，切换阀Ｂ，体积排阻柱Ａ，体积排阻柱Ｂ和检测器。泵、进样阀、体积排阻柱Ａ、切换阀Ａ、体积排阻色谱柱Ｂ、检测器、切换阀Ｂ和三通或四通连接头通过管路依次相连，通过调节阀Ａ的切换频率或模式可以控制进入循环分离系统的生物大分子的数量，调节阀Ｂ的切换可以控制生物大分子组分的分离与收集，该系统与传统的体积排阻色谱方法相比具有分离能力强、分辨率高等特点，可用于生物大分子样品的分离纯化。同时，该系统在构建连续生物大分子多维分离平台中也具有很好的实用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及蛋白分离纯化系统，具体地说是一种柱切换循环体积排阻色 谱分离系统。技术背景在生物大分子的分离中，离子交换色谱和体积排阻色谱是最常用的两种 分离技术。而体积排阻色谱由于分离条件温和，容易保存生物分子的活性， 因此常被用于生物分子的分离与纯化。和其它的分离模式相比，体积排阻 色谱被认为是一种分辨率低的液相色谱方法，因此限制了它在生物大分子 分离中的应用。为了提高分辨率，通常会采用更长的色谱柱或者使用更细 粒径的填料装填的色谱柱，然而柱压太高也使该方法很难付诸于实践。循 环体积排阻色谱是一种提高分辨率的液相色谱方法，样品可以在一根色谱 柱内进行无数次重复的分离，因此可以说是无限制地增加柱长，从而可以 获得很高的分辨率。然而，随着分离时间的增长，谱峰随之展宽，分离开 的色谱峰(分子量范围宽的蛋白、核酸等)在多次循环分离后可能还会重
技术实现思路
为了克服这一缺陷，申请人建立了柱切换循环体积排阻色谱系统，该方 法是将预分离开的生物大分子捕集在第二根体积排阻色谱柱上，通过控制 阀切换，将分子量相似的生物大分子切入循环系统中分离，得到满意的分 离度后，对分离开的组分进行收集。然而，再从捕集柱切出一小部分进行 循环分离，依次类推。这种方法适用实际复杂样品的分离纯化，具有更高 的使用价值。本专利技术的目的在于提供一种以体积排阻色谱为分离模式的生物大分子 分离装置，利用该装置可以分离纯化生物大分子，获得更高纯度的生物大 分子，同时还构建连续生物大分子多维分析平台。该装置设计简单，分辨 率高，分离效果好，实用性强。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为一种用于生物大分子分离纯化的柱切换循环体积排阻色谱系统，其特征 在于包括液相色谱泵、切换阀、体积排阻色谱柱A、体积排阻色谱柱B、 检测器，它们通过管道以闭合环路的形式相连；体积排阻色谱柱A —端与进样阀相连、另一端通过一切换阀A分别与 体积排阻色谱柱B、检测器相连，进样阀的外端通过泵经三通接头分别与 外界的流动相源及检测器出口相连接，三通接头与检测器的连接管路上设置有切换阔B，检测器通过切换阀B 与收集瓶或废液瓶相连。所述切换阀A为六通阀或十通阀，它分别与体积排阻色谱柱A、体积 排阻色谱柱B和检测器相连。所述进样阀由定量环与六通阀或十通阀组成，进样阀通过六通阀或十通阀串连于体积排阻色谱柱A与泵的连接管路中；所述检测器为紫外检测器、质谱或其他类型检测器。泵、进样阀、体积排阻柱A、切换阀A、体积排阻色谱柱B、检测器、切换阀B和三通或四通连接头通过管路依次相连，通过控制切换阀A可以控制进入循环分离系统的生物大分子的数量，控制阀B的切换可以控制生 #勿*力v ^乡且么v白勺#胃 * o具体分析过程如下在循环分离前，通过阀A使两根体积排阻色谱柱 串联在一起。生物大分子样品首先通过体积排阻色谱柱A分离，然后捕集 在体积排阻色谱柱B中，当一小部分生物大分子从体积排阻色谱柱B中被 洗脱下来时，切换阀A和阀B，此时泵、体积排阻色谱柱A、检测器通过 一个三通或四通连接接头形成一个闭合环路中，此时生物大分子样品可以 不断地在该系统中分离直至达到满意的分离结果，而其它的样品则被保留 在第二根色谱柱中。第一部分生物大分子完成分离后，生物大分子组分被 切出系统收集下来。另一小部分生物大分子从第二根色谱柱中切出，进行 循环分离，依次类推。生物大分子经体积排阻色谱柱A、体积排阻色谱柱B依次分离后，通 过控制切换阀，相似分子量大小的样品依次从体积排阻色谱柱B上切入循 环系统中，并以体积排阻色谱柱A为分离柱进行循环分离，直至达到满意 的分离度。以体积排阻色谱柱A为分离柱，生物大分子样品以循环分离的方式进 行分离。体积排阻色谱柱A的柱体积要小于体积排阻色谱柱B。生物大分 子以峰切割的方式从体积排阻色谱柱B中进入循环系统。体积排阻色谱柱 B具有分离和捕集的双重作用。本专利技术所述生物大分子可以为蛋白质或核酸;本专利技术可以用于生物大分 子的分离与纯化，同时可以作为构建连续生物大分子多维分离平台的重要 部件。该系统与传统的体积排阻色谱方法相比具有分离能力强，分辨率高 等特点，可用于生物大分子样品的分离纯化。同时，该系统在构建连续生 物大分子多维分离平台中也具有很好的实用价值。本专利技术的有益效果是1. 该系统采用循环分离的方式，不需要增加柱长或减小粒径，就可以 极大提高分辨率，改善分离效果。2. 由于采用体积排阻色谱分离模式，以低盐缓冲溶液为洗脱剂，因此，蛋白在分离纯化后仍然能保持活性。3. 该系统采用两根体积排阻色谱柱，其中体积排阻色谱柱A为分离柱，体积排阻色谱柱B为样品捕集柱。蛋白样品通过体积排阻色谱柱A分离后， 捕集在体积排阻色谱柱B中，通过从体积排阻色谱柱B切割出小部分的蛋 白进入循环系统，可以实现对分子量范围很宽的蛋白质的分离纯化。4. 在构建多维生物大分子分离平台时，采用该系统作为生物大分子分 离的第一维可以保证两维分离的连续性。5. 该系统设计简单，分辨率高，分离效果好，实用性强，具有很好的 推广价值。附图说明图1、柱切换循环体积排阻色谱装置图，(1)、三通接头；(2)、泵；(3)、 进样阀；(4)、体积排阻色谱柱A; (5)、切换阀A; (6)、体积排阻色谱柱 B; (7)、检测器、(8)、切换阀B, (9)、收集器或废液瓶，(10)、流动 相C, (11)、进样针或进样器，(12)、废液瓶A。图2、串联体积排阻色谱(a)和柱切换循环体积排阻色谱(b,c,d)分离五 种标准蛋白。分离条件色谱柱SEC SRT-150A和SEC nanofilm-250A， 流动相C: 10mMTris-HCl+150mMNaCl+5%ACN，流量150 |LiL/min;检测 215nm.图3、柱切换体积排阻色谱-反相色谱分离平台装置图，(1)、三通接头； (2)、泵；(3)、进样阀；(4)、体积排阻色谱柱A; (5)、切换阀A; (6)、 体积排阻色谱柱B; (7)、检测器A; (8)、切换阀B; (9)、切换阀C; (10)、 流动相C; (11)、进样针或进样器；(12);废液瓶A; (13)、 C8捕集柱A;(14)C8捕集柱B; (15)反相色谱柱;U6)、检测器B， (17)、泵B， (18)、 流动相D，(19)、废液瓶B， (20)、废液瓶C, (21)、泵C， (22)、泵D。 图4、七种标准蛋白的二维分离图。(a)图为第一维柱切割循环体积排阻色谱分离图。(b)图为第二维反相色谱分离图。第一维分离条件色谱柱SEC SRT-150A和SEC nanofilm-250A，流动相C: 10mM Tris-HCl+150mM NaCl+5%ACN，流动相D: 50mM Tris-HCl+2%ACN，流量150 (iL/min;检 测215nm.第 二 维分离条件流动相 A:2%ACN+0.1%TFA,B:98%ACN+0.1%TFA;梯度0-lmin， 0%B, 1-3min, 0%-20%B, 3-14min， 20%-80%B, 14-15min, 80%B，15-15.01min, 80%-0%B， 15.01-20min, 0%B; 流量2mL/min;检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于生物大分子分离纯化的柱切换循环体积排阻色谱系统，其特征在于：包括液相色谱泵、切换阀、体积排阻色谱柱Ａ、体积排阻色谱柱Ｂ、检测器，它们通过管道以闭合环路的形式相连；　体积排阻色谱柱Ａ（４）一端与进样阀（３）相连、另一端通过一切换 阀Ａ（５）分别与体积排阻色谱柱Ｂ（６）、检测器（７）相连，　进样阀（３）的外端通过泵（２）经三通接头（１）或四通接头分别与外界的流动相源及检测器（７）出口相连接，　三通接头（１）或四通接头与检测器（７）的连接管路上设置有切换阀Ｂ （８），检测器（７）通过切换阀Ｂ（８）与收集瓶或废液瓶相连。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽华，袁辉明，梁振，张玉奎，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：91[中国|大连]