本发明专利技术公开一种重组人干扰素α２ｂ的发酵后处理工艺，从表达人干扰素α２ｂ的工程菌中提取重组人干扰素α２ｂ，包括如下步骤：１）酵母发酵液中菌体的去除，２）发酵上清中目的蛋白质的浓缩和缓冲液的替换，３）疏水层析初步纯化，４）体积排阻层析纯化。本发明专利技术减少了设备成本、生产成本、降低了能耗、减少环境污染，提高了产品的临床安全性；同时本发明专利技术工艺稳定简单，适合大规模生产，生产过程安全可控，生产效率高，显著的降低能耗，无环境污染，有显著的经济效益，生产产品质量标准符合２０１０版中国药典标准。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种重组人干扰素α 2b的发酵后处理工艺。
技术介绍
干扰素(IFN)是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细 胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制；同时还可增强自然杀 伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能 力。干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质(主要是糖蛋白)，是一种由单核细胞和淋 巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、 调节免疫功能等多种生物活性。干扰素按制作方法不同，可分为利用基因工程生产的重组 干扰素和人天然干扰素两大类。人天然干扰素分为三种多肽IFN-a、IFN-β及IFN-γ。 IFN-α和IFN-β分别由白细胞和成纤维细胞产生，在酸性环境中稳定，并且结合相同的受 体。而IFN-Y主要由T淋巴细胞分泌，对酸不稳定，结合的受体与前两者不同，IFN-Y的免 疫刺激活性在三者中最强。IFN-β和IFN-γ只由单个基因编码，而IFN-α由至少23个不 同基因，群聚在第9对染色体上，编码产生多于15种的功能蛋白。基因工程干扰素再按基 因表达分子结构和抗原性可分为α、β、Y型，同一型内按氨基酸组成差异再分20多个亚 型α 1、α 2、α 3……在同一亚型内又因氨基酸的差异而细分，如α 2 有三种α 2a、α 2b、 α 2c。人天然干扰素是通过分别刺激淋巴母细胞和人体白细胞，然后提纯制备而得。目前 市场供应的只有由类淋巴母细胞产生的干扰素(IFN)…α Ni，是天然的多亚型的混合物。临 床用的主要是重组制剂，有α 2a、α 2b和α 2c。人干扰素α作为21世纪抗病毒、抗癌症 最为广泛的药物之一，临床应用的需求量越来越高，如何使人干扰素α大规模产业化生产 成为了重要课题。早期人白细胞干扰素α是用生长在组织培养物种的人细胞系表达的或是通 过从血液供体中收集的人白细胞生产的，美国专利US4680261，US5503828, US5391713， US4732683,US4696899,US5789551和欧洲专利ΕΡ0945463详细地阐述了这些方法。这些方 法生产成本高，生产周期长，产量低，存在污染风险，不适合工业化放大生产。20世纪70年代后期，随着基因工程技术的出现及发展，人干扰素α可以通过基 因重组的方式生产，然而目前重组人干扰素α的生产纯化大多用到亲和抗体柱或液相反 相柱，纯化成本高，生产工艺难于工业化放大等缺点；如美国专利US5710027、US5661009U、 US4765903、US5196323、和中国专利 CN100390198C、CN1876811A 等。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种重组人干扰素α 2b的发酵后处理工艺。本专利技术采 用微滤和超滤替代硫酸铵沉淀和离心，无需大规模采用离心机，减少了设备成本，并降低了 能耗，同时也避免大量使用硫酸铵，降低生产成本，减少环境污染；本工艺采用常规的疏水 及体积排阻层析柱，无需采用反相层析柱和昂贵的单克隆亲和柱，避免有机溶剂的使用和亲和层析柱上脱落的单克隆抗体的污染，提高了产品的临床安全性；本生产工艺稳定简单， 适合大规模生产，生产过程安全可控，生产效率高，显著的降低能耗，无环境污染，有显著的 经济效益，生产产品质量标准符合2010版中国药典标准。为了达成上述目的，本专利技术的解决方案是一种重组人干扰素α 2b的发酵后处理工艺，从表达人干扰素α 2b的工程菌中提 取重组人干扰素α 2b，包括如下步骤1)重组人干扰素α 2b酵母发酵液中菌体的去除，2) 发酵上清中目的蛋白质的浓缩和缓冲液的替换，3)疏水层析初步纯化，4)体积排阻层析纯 化。所述的步骤1)中，采用微滤技术，选用中空纤维膜管，替换缓冲液为PH值 6. 3士0. 1的20mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)，并添加浓度为0. 5%的Vc，IOmM的EDTA，浓度 为 0. 03% 的 Tween80。所述的微滤采用0. 45um中空纤维膜管。所述的步骤2)中，采用超滤技术，选用中空纤维膜管，替换缓冲液为pH值 6. 5士0. 1的20mM磷酸缓冲液(PBNa)，并添加浓度为0. 5% Vc和0. 05% Tween80。所述的超滤采用5K中空纤维膜管。所述的步骤3)中疏水层析洗脱缓冲液采用缓冲液A和缓冲液B，利用疏水层析 柱进行纯化，疏水填料选用Octyl Sepharose 4FastFlow(GE公司)，缓冲液A为pH值 6. 5 士0. 05的20mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，0. 8M(NH4) 2S04，浓度为0. 02%二甲基亚 砜(DMSO)，缓冲液B为pH值6.5士0. 05的20mM HEPES和浓度为0. 02%二甲基亚砜。所述的步骤4)中采用缓冲液C，利用体积排阻交换柱进行体积排阻层析，具体选 用 Superdex 75 (GE 公司)，缓冲液 C 为 pH 值 7. 0 士 0. 1 的 20mM PBNa。本专利技术的有益效果为(1)微滤和超滤中使用了行之有效的稳定保护剂，在微滤 和超滤过程中会伴随着剧烈的搅拌和剪切，重组人干扰素α 2b容易发生不同程度的氧化 和聚集，影响后续的处理，增加了纯化的难度，因此本专利技术通过一系列的实验研究发现，在 微滤替换缓冲液中添加0. 5%VcU0mM EDTA和0. 03% Tween 80，在超滤替换缓冲液中添加 0.5% Vc和0.05% Tween 80，可以有效的阻止目的蛋白质发生氧化和聚集，并且Tween 80 明显降低微滤和超滤膜的蛋白吸附量，显著提高回收率。(2)独特的疏水纯化步骤，通过对疏水纯化的摸索实验，意外的发现采用pH值 6. 5 士0. 05的20mM HEPES并添加0. 02%二甲基亚砜的缓冲液，可以显著提高疏水纯化的分 离效率，一步疏水纯化就可以达到捕获目的蛋白和去除大部分杂质的目的，疏水纯化后干 扰素α 2b的纯度大于95%以上，消除了发酵的波动，为后续的纯化奠定了良好的基础。(3)工艺简单可控，适合大规模生产，生产过程安全可控，生产效率高，纯化得率高 (最终纯化得率40% )，显著的降低能耗，无环境污染，有显著的经济效益。(4)通过本专利技术纯化方法得到的原液，质量标准达到2010版中国药典的标准， 反相色谱纯度达到95%以上，SDS-PAGE纯度法达到98%以上，残余工程菌蛋白含量低于 0. 005%，低于国家标准的10分之1，细菌内毒素每毫克低于0. 25EU，仅相当于国家标准的 120 分之 1 (标准为 10EU/300 μ g)。(5)高载量、高流速处理大体积样品，大大缩短工艺时间，可进行大规模生产工 艺单批规模可达到IOOg以上。本专利技术的另一个明显优势是避免使用反相层析柱和单克隆层析柱。乙腈和甲醇 经常作为反相层析柱纯化洗脱试剂，以达到蛋白质精细纯化，获得高纯度的目的蛋白质。当 在规模化生产中使用进行蛋白的纯化时，乙腈和甲醇等有机溶剂的用量很大，它们都属于 有毒性的溶剂，大量使用有机溶剂带来一系列的问题不仅价格昂贵，生产成本过高；样品 中的残余溶剂可能带来安全性隐患；废水的处理会产生大量的环保处理费用；如排放到环 境中，本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
一种重组人干扰素α2b的发酵后处理工艺，其特征在于从表达人干扰素α2b的工程菌中提取重组人干扰素α2b，包括如下步骤1)重组人干扰素α2b酵母发酵液中菌体的去除，2)发酵上清中目的蛋白质的浓缩和缓冲液的替换，3)疏水层析初步纯化，4)体积排阻层析纯化。2.如权利要求1所述的一种重组人干扰素α2b的发酵后处理工艺，其特征在于所述 的步骤1)中，采用微滤技术，选用中空纤维膜管，替换缓冲液为PH值6.3士0. 1的20mM三羟 甲基氨基甲烷(Tris)，并添加浓度为0. 5%的Vc，IOmM的EDTA，浓度为0. 03%的Tween80。3.如权利要求2所述的一种重组人干扰素α2b的发酵后处理工艺，其特征在于所述 的微滤采用0. 45um中空纤维膜管。4.如权利要求1所述的一种重组人干扰素α2b的发酵后处理工艺，其特征在于所述 的步骤2)中，采用超滤技术，选用中空纤维膜管，替换缓冲液为pH值6. 5士...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙黎，肖清江，尹凤红，汪铁兵，苏诗蟠，张茜，
申请(专利权)人：厦门特宝生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：92
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