一种高效无细胞体外表达蛋白的体系制造技术

本发明专利技术涉及一种大肠杆菌无细胞表达体系的建立方法，不需要额外添加tRNA、T7 RNA聚合酶、细胞拥挤剂以及各种激酶的成分，便可经济快速地实现荧光蛋白eGFP的高效表达，在2小时即可实现3.35 mg/mL的表达水平，具有重要的研究意义和应用价值。究意义和应用价值。究意义和应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种高效无细胞体外表达蛋白的体系


[0001]本专利技术属于生物
，涉及无细胞体外表达蛋白的系统。

技术介绍

[0002]无细胞蛋白质合成(cell
‑
free protein synthesis, CFPS)也被称为体外蛋白质转录翻译技术，在20世纪60年代该概念初次提出，至今已发展完善了60余年。和体内表达技术相比，该技术不需要转染细胞、细胞培养及蛋白纯化过程，只需要目的片段的质粒或者扩增产物以及转录和翻译过程中所需的原料、能量物质和元件等即可启动表达，因此，具有相当优越的表达效率，一般在2小时至12小时就可以获得表达产物。且在合成生物学中，无细胞表达是一种重要的体外表达方式，经常用于难以实现体内表达的蛋白的合成，例如：膜蛋白，毒性蛋白等。
[0003]CFPS系统具有多样性，目前市面上最常见的商业化试剂盒有大肠杆菌表达体系、小麦胚芽表达体系和PURE体系等。在无细胞表达中，蛋白表达量大于1 mg/mL被认为是高效表达系统，大肠杆菌表达系统就是其中代表，在以大肠杆菌作为细胞提取物来源的无细胞合成体系中，合成的技术和方法是该领域所熟知的。2021年David Garenned等人发表的文章中详细汇总了大肠杆菌无细胞表达系统平台的建立方法，包括大肠杆菌细胞提取物的制备方式、能量体系的选择、盐类和氨基酸的浓度等。
[0004]目前大肠杆菌无细胞表达体系表达水平一般在0.1
‑
1.5 mg/mL，2014年Filippo Caschera等人用大肠杆菌无细胞体系表达荧光蛋白deGFP的水平达到了2.3 mg/mL，2011年Jonghyeon Shin等人同样用大肠杆菌无细胞体系表达deGFP，达到了3 mg/mL的表达水平，但这两者在制备细胞提取物时均加入了IPTG以提高T7 RNA聚合酶的表达，而且也都在表达体系中添加了0.2 mg/mL tRNA和dNTP，以达到提高转录和翻译效率的目的，大幅提高了无细胞表达的成本，更适用于高附加值产物的生产应用。
[0005]因此，建立一个对大多数蛋白表达都经济适用，且能实现高效表达的无细胞表达体系是具有重要的科研和应用价值的。

技术实现思路

[0006]本专利技术的技术涉及无细胞表达系统，进一步地涉及大肠杆菌无细胞表达系统，本专利技术的目的是提供一种低成本、高产率经济适用的大肠杆菌无细胞表达系统的方法，包括大肠杆菌细胞提取物的制备、能量再生体系的组合以及体外表达的方法。
[0007]本专利技术首先提供一种稳定获得高活性大肠杆菌细胞提取物的制备方法，其包括如下步骤：S1 采用CFPS培养基培养大肠杆菌，所述CFPS培养基的制备方法如下：18
‑
22 g蛋白胨，4
‑
6 g酵母提取物，4
‑
6 g氯化钠，3
‑
5 g 乳糖，0.4
‑
0.6 g无水葡萄糖，4
‑
8 mL甘油调节pH到7.2
‑
7.4后定容至700 mL，灭菌8
‑
10 g磷酸氢二钾和2
‑
4 g磷酸二氢钾定容到300 mL，灭菌；两者灭菌后无菌条件下混匀；
S2培养至OD
600
达到3.0
‑
4.0时离心收集菌体；S3重悬菌体后超声破碎菌体，在使用之前加入二硫苏糖醇至少洗一次即加入二硫苏糖醇于破碎液中混匀，离心获得上清液即为反应体系中的细胞提取物，直接使用或冻存在
‑
80℃保存备用。
[0008]优选地，所述CFPS培养基的制备方法如下：20 g蛋白胨，5 g酵母提取物，5 g氯化钠，4 g 乳糖，0.5 g无水葡萄糖，6 mL甘油调节pH到7.2
‑
7.4后定容至700 mL，115 ℃，30 min灭菌；9.13 g磷酸氢二钾和3 g磷酸二氢钾定容到300 mL，121 ℃，20 min灭菌；两者灭菌后在超净工作台混匀。
[0009]另外优选地，所述大肠杆菌是大肠杆菌BL21star(DE3)。
[0010]进一步优选地，培养至OD
600
达到3.4
‑
3.6时离心收集菌体。
[0011]另外优选地，S3中，二硫苏糖醇的浓度是10
‑
15mM，离心是于10000
‑
14000 rpm离心获得上清液。
[0012]要想实现体外蛋白表达水平的提高，常规思路会额外添加T7 RNA聚合酶和tRNA这些成分，以提高转录和翻译效率，另外也会加入像PEG8000这种分子拥挤剂来模拟细胞环境，而这些成分价格昂贵。本专利技术通过对培养基成分改进：除了常规的酵母粉、蛋白胨、盐类和甘油之外，加入了乳糖和葡萄糖，乳糖能够代替IPTG的作用，提高细胞本底的T7 RNA聚合酶的表达量，而不需要额外添加，在细胞合成T7 RNA聚合酶的同时，细胞体内的tRNA的含量会增高，这样就也省去了tRNA的添加，降低了体外表达的成本。
[0013]本专利技术进一步提供一种高效无细胞表达蛋白的体系，其包括如下成分：HEPES、PEP、NAD、草酸、亚精胺、NMP混合液、ATP、氨基酸混合液、作为模板的携带有目的蛋白基因的体外表达质粒、谷氨酸钾、谷氨酸镁，以及所述制备方法得到的大肠杆菌细胞提取物。
[0014]优选地，所述的体系包括如下成分：140
‑
160 mM pH7.5 的 HEPES、30
‑
36 mM PEP、0.3
‑
0.5 mM NAD、3
‑
5 mM草酸、1.2
‑
1.8 mM亚精胺、各NMP浓度分别为4
‑
6 mM的NMP混合液、2.5
‑
2.7 mM ATP、1.5
‑
2.5 mM 氨基酸混合液，3
‑
7 ng/uL模板，28
‑
37%（v/v）大肠杆菌细胞提取物，90
‑
110 mM谷氨酸钾和6
‑
10 mM谷氨酸镁。
[0015]更优选地，所述的体系包括如下成分：140 mM pH 7.5的HEPES、33 mM PEP、0.4 mM NAD、4 mM草酸、1.5 mM亚精胺、各NMP浓度分别为5 mM的NMP混合液、2.6 mM ATP、2 mM 氨基酸混合液，5 ng/uL模板，33%（v/v）大肠杆菌细胞提取物，100 mM谷氨酸钾和8 mM谷氨酸镁。
[0016]本专利技术进一步提供一种利用所述的体系表达目标蛋白的方法，其包括如下步骤：将所述的体系，在400
‑
600 rpm，28
‑
32℃下反应1
‑
3 h，收集表达获得的目标蛋白。
[0017]由此，本专利技术也提供所述的体系在生产蛋白质中的应用。
[0018]本专利技术通过替换4种常规的核本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种稳定获得高活性大肠杆菌细胞提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1 采用CFPS培养基培养大肠杆菌，所述CFPS培养基的制备方法如下：18
‑
22 g蛋白胨，4
‑
6 g酵母提取物，4
‑
6 g氯化钠，3
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5 g 乳糖，0.4
‑
0.6 g无水葡萄糖，4
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8 mL甘油调节pH到7.2
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7.4后定容至700 mL，灭菌8
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10 g磷酸氢二钾和2
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4 g磷酸二氢钾定容到300 mL，灭菌；两者灭菌后无菌条件下混匀；S2培养至OD
600
达到3.0
‑
4.0时离心收集菌体；S3重悬菌体后超声破碎菌体，在使用之前加入二硫苏糖醇至少洗一次即加入二硫苏糖醇于破碎液中混匀，离心获得上清液即为反应体系中的细胞提取物，直接使用或冻存在
‑
80℃保存备用。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述CFPS培养基的制备方法如下：20 g蛋白胨，5 g酵母提取物，5 g氯化钠，4 g 乳糖，0.5 g无水葡萄糖，6 mL甘油调节pH到7.2
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7.4后定容至700 mL，115 ℃，30 min灭菌；9.13 g磷酸氢二钾和3 g磷酸二氢钾定容到300 mL，121 ℃，20 min灭菌；两者灭菌后在超净工作台混匀。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌是大肠杆菌BL21star(DE3) 。4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，培养至OD
600
达到3.4
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3.6时离心收集菌体。5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S3中，二硫苏糖醇的浓度是10
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15mM，离心是于10000
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14000 rpm离心获得上清液。6.一种高效无...

【专利技术属性】
技术研发人员：毕悦欣，朱柳杨，张晓立，张慧泽，李华珍，章家泉，
申请(专利权)人：百葵锐天津生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：