一种裂解酶酶活性测定方法技术

本发明专利技术提供一种裂解酶酶活性测定方法，该方法包括酶活检测体系、检测方法及应用。本方案包含的裂解酶活性的定性定量检测方法，检测程序简单易操作，反应体系微量化，且数据结果成线性分布，解决了裂解酶的酶活检测和进化筛选过程中耗时长、成本高、可重复性差、难以进行高通量筛选等诸多问题。高通量筛选等诸多问题。高通量筛选等诸多问题。

【技术实现步骤摘要】
一种裂解酶酶活性测定方法


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种能够有效检测裂解酶活性的方法及其应用。

技术介绍

[0002]随着微生物病原体法的演化，以及抗生素药物的滥用，新型耐药机制正不断涌现，多种耐药菌和泛耐药菌的出现已成为21世纪主要的公共卫生威胁之一，严重危害了人们的生命健康安全。此外抗生素也逐渐暴露更多问题，如破坏有益菌群、破坏器官、产生免疫效应、过敏反应等。面对使用经典抗生素产生种种问题，人们迫切寻求一种可替代的治疗方案，而近年来各种来源的胞壁裂解酶走入了人们的视野。这类裂解酶具有降解肽聚糖的潜力，在外源添加时可作为有效的抗菌剂。
[0003]天然裂解酶往往具有高度的宿主特异性和强烈的裂解活性，能破坏细菌生物膜，而且具备绿色安全、不易产生耐药等优势。同时，裂解酶具有无限研究潜力，运用蛋白质工程技术、合成生物学技术将其重组改造，可增强其裂解活性、提高稳定性以及靶向性，这使其在成为新型抗菌药物方面拥有广阔的前景，而且做为大分子蛋白，法规监管路径也很清晰。裂解酶的优势主要在以下三点：（1）不易引起细菌耐药性：裂解酶的结合结构域针对特定菌体的细胞壁，能够特异性识别并杀死菌体，使其很难产生耐受性。
[0004]（2）作用快、可穿透生物膜：裂解酶在体外与菌体接触的瞬间迅速破裂细胞，可使菌体浊度迅速下降，引起吸光值降低。
[0005]（3）不破坏有益细菌和生物菌群：研究发现，裂解酶反应时不会对人体的正常菌群产生影响，而抗生素在杀死病原菌的同时，却损伤了部分正常菌群。
[0006]目前主流的裂解酶活性测定主要靠抑菌试验完成。根据其应用场景不同，抑菌实验分成诸多种类，如基于生长菌落个数的涂布平板法、倾注平板法、预加菌液倾注平板法，以及基于抑菌圈大小的平板打孔法、滤纸片法（又称K
‑
B法，Kirby
‑
Bauer test）、牛津杯法等。
[0007]基于生长菌落个数的三种方法
①
涂布平板法：将裂解酶与菌液混合孵育，倒在凝固的固体培养基上均匀涂开；
②
倾注平板法：先往已灭菌的平板中接种混合孵育后的裂解酶与菌液，然后倾注已冷却至50 ℃左右的平板培养基，混合均匀，水平静置凝固后放入培养箱培养；
③
预加菌液倾注平板法：往已冷却至50℃左右的平板培养基中注入一定量的混合孵育后的裂解酶与菌液，混合均匀，倾注平板，水平静置凝固后放入培养箱培养。
[0008]基于抑菌圈大小的三种方法
①
平板打孔法：是指用已灭菌的打孔器或钢管在平板上打孔，往孔中注入一定量的待测样品，培养一段时间后测定抑菌圈大小；
②
滤纸片法：选用质地均匀的滤纸，用打孔机打成直径相同的圆片，灭菌后烘干，浸泡于待测样品中，然后置于试验平板中培养一段时间后测定抑菌圈大小；
③
牛津杯法：又称杯碟法，将已灭菌的牛津杯置于试验平板中，往杯中注入一定量的待测样品，培养一段时间后测定抑菌圈大小。
[0009]以上几种方法实验效果直观，但也存在诸多缺点。
[0010]首先，以上方法对于抑菌活性低的裂解酶难以分辨，如抑菌圈大小、平板法菌落个数变化难以测量，且可能在误差范围内；而裂解酶活性显著时，平板法生长菌落数量过低甚至无菌落生长，难以检测区分酶的活性差异；其次，实验重复性差，不易定量，存在误差。平板法的菌落生长状态极易受到外界因素影响，如培养基倾倒不易定量、无法控制冷却时间，甚至部分菌体在未完全冷却的培养基倾倒过程中失活，涂布不均匀的情况下菌体生长也会受到很大影响，而抑菌圈法中滤纸片难以对酶进行定量，牛津杯以及打孔法也要考虑渗透因素、快速点样等；在进行大量实验时成本高、周期长。不论是平板法还是抑菌圈法，完成整体流程也需要三天时间（底物菌种培养、混合孵育抑菌、平板培养），且在进行大规模筛选时实验操作耗费大量时间成本，且检测数据难以统计分析。
[0011]此外，国标GB/T30990
‑
2014溶菌酶活性检测方法也是一种应用广泛的抑菌方案，然而其使用底物为溶壁微球菌，对菌种特异性的裂解酶并不适用。

技术实现思路

[0012]考虑到目前现有技术缺陷，本专利技术旨在开发一种基于比浊法原理的裂解酶活性快速测定方法。该方法具有准确快速且通量高、可重复性好、数据稳定线性等诸多优点，为裂解酶活性测定提供了切实可行的方案。
[0013]本专利技术提供一种能够有效检测裂解酶活性的方法，包括如下步骤：第一步，将培养已过对数生长期的特异性底物菌离心，收集菌体，使用0.1M 磷酸盐缓冲液重悬；第二步，将底物菌悬浊液加入测定板，使用酶标仪测量菌体吸光值，将其稀释至OD450nm=0.8~1.1；第三步，将底物菌与裂解酶以15
‑
25：1的比例混合加入多孔板，间隔测定吸光值，观察吸光值变化量；第四步，计算裂解酶活性。
[0014]具体地，所述特异性底物菌包括但不限于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产气荚膜菌，所述裂解酶包括但不限于金黄色葡萄球菌裂解酶（包括但不限于Lysostaphin、CF301、P128、lysK）、大肠杆菌裂解酶（如lysAB2）、产气荚膜菌裂解酶（如cps2）；优选地，所述特异性底物菌培养已过对数生长期是指培养14
‑
18h，优选为15
‑
17h。
[0015]优选实施方式中，第三步中所述裂解酶的浓度稀释至0.2
‑
0.6mg/mL，优选为0.4mg/mL。
[0016]进一步优选地，第三步中，底物菌与裂解酶以18
‑
20：1的比例混合加入多孔板。
[0017]具体地，所述测定板是多孔板，例如48孔板、64孔板、96孔板、128孔板。
[0018]优选地，第四步中间隔测定吸光值每15s测一次吸光值，且观察10min内吸光值变化量。
[0019]具体实施方式中，其中用0.1M磷酸盐缓冲液作为空白对照。
[0020]优选地，第三步中间隔测定吸光值是在室温下进行，例如25℃室温下进行。
[0021]在一个实施方式中，第四步中计算裂解酶活性的方法如下：一个裂解酶活力单位定义为25℃，pH7.5条件下，使用特异性底物菌悬浊液在450nm处每分钟引起吸光值变化为0.001所需裂解酶的量；则裂解酶活性X，按下式计算：
[0022]式中：A1：试样在450nm处反应1min时的吸光度A2：试样在450nm处反应nmin时的吸光度A0：空白对照在450nm处反应nmin
‑
1min的吸光度变化，及菌体自然沉降t：反应时长，值为n
‑
10.01：样品添加量10μL0.001：由单位裂解酶每分钟引起的吸光度降低的值。
[0023]本专利技术通过研究和分析获得的一种稳定、快速、高效的裂解酶活性测定方法，所得数据具有良好的线性关系。且本专利技术评估了不同裂解酶样品，进行裂解酶活性测定，该方法均可以成功检测并计本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种裂解酶酶活性测定方法，其特征在于，其包括如下步骤：第一步，将培养已过对数生长期的特异性底物菌离心，收集菌体，使用0.1M 磷酸盐缓冲液重悬；第二步，将底物菌悬浊液加入测定板，使用酶标仪测量菌体吸光值，将其稀释至OD450nm=0.8~1.1；第三步，将底物菌与裂解酶以15
‑
25：1的比例混合加入多孔板，间隔测定吸光值，观察吸光值变化量；第四步，计算裂解酶活性。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特异性底物菌选自金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产气荚膜菌，所述裂解酶选自金黄色葡萄球菌裂解酶、大肠杆菌裂解酶、产气荚膜菌裂解酶；所述特异性底物菌培养已过对数生长期是指培养14
‑
18h。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第三步中所述裂解酶的浓度稀释至0.2
‑
0.6mg/mL。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第三步中，底物菌与裂解酶以18
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20：1的比例混合加入多孔板。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测定板是多孔板。6.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：张慧泽，李瑞琦，张晓立，李华珍，章家泉，
申请(专利权)人：百葵锐天津生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：