本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种原核无细胞蛋白质合成系统及其应用。本发明专利技术通过优化细胞培养及提取物的制备过程和CFPS反应体系及反应条件开发并建立了以红球菌（Rhodococcus rhodochrous）为底盘菌的无细胞蛋白质合成系统；利用该系统目标蛋白的表达量较优化之前提升10倍左右。本发明专利技术开发的红球菌CFPS系统不仅扩展了当前无细胞蛋白质合成（CFPS）系统库，同时扩展红球菌体系在合成生物学领域的应用，例如快速蛋白质合成、遗传电路原型和代谢途径构建，快速高效生产有价值的化学品和材料等，红球菌无细胞蛋白质合成系统的建立也为功能酶高效筛选平台提供可能性，加速高性能酶筛选。高性能酶筛选。高性能酶筛选。
【技术实现步骤摘要】
一种新的原核无细胞蛋白质合成系统及其应用
[0001]专利技术属于生物
，涉及一种新的原核无细胞蛋白质合成系统，包括自身的应用，以及生产方法。
技术介绍
[0002]无细胞蛋白质合成(CFPS)系统使用粗细胞提取物代替完整细胞来完成体外转录和翻译，是蛋白质合成和生物学应用的强大平台。由于无细胞系统的开放性，CFPS反应具有许多优点，例如易于操作、高产率和对有毒产物的耐受性。CFPS技术已经应用于各种蛋白质的生产，包括膜蛋白、治疗蛋白、金属酶和非天然氨基酸修饰蛋白。
[0003]CFPS系统是从不同的原核和真核或生物体（如大肠杆菌、酵母、小麦胚芽和哺乳动物细胞）开发而来的。虽然这些成熟的CFPS系统得到了广泛的应用，但它们各有优缺点。例如，在所有报告的无细胞系统中，大肠杆菌CFPS的整体生产力目前是最高的（表达蛋白质约为1000
µ
g/mL）；然而，基于大肠杆菌的细胞提取物缺乏翻译后修饰机制（例如糖基化），因此它们不适合表达真核蛋白。
[0004]另一方面，真核生物衍生的CFPS系统的制备步骤很费力，而且它们的蛋白质产量通常很低（<50
µ
g/mL）。最近，对CFPS技术的兴趣推动了新的无细胞系统的开发，其中包括链霉菌属、枯草芽孢杆菌、恶臭假单胞菌和需钠弧菌等。开发新的CFPS系统不仅将扩展用于体外蛋白质合成的工具包，更重要的是，这些系统可以更好地模拟细胞内源环境以实现高质量的蛋白质表达（例如，增强的溶解度和翻译后修饰）。因此，源自非模型底盘微生物的CFPS系统的开发对合成生物学和生物
的特定应用越来越有吸引
力
。
[0005]红球菌是需氧、无孢子的革兰氏阳性细菌，广泛分布在各种营养条件。一个显著的特征是，红球菌菌株表现出多样化的代谢活动，使其能够降解和转化不同类型的有机污染物，如短链、长链、卤代烃和众多芳香烃。因此，它们已成功应用于污染土壤、水和空气的生物修复。这一因素也使红球菌成为工业废物或木质纤维素生物质原料的理想平台，以生产有价值的化学品，如生物燃料和羧酸。红球菌已广泛应用于工业生产腈水合酶(NHase)、腈酶和酰胺酶，可以催化丙烯腈转化为丙烯酰胺和丙烯酸铵或芳香族酰胺和杂环酰胺转化为相应的酸。因此，红球菌在制药、环境和工业领域具有相当重要的意义，被认为是制造化学品的微生物平台之一。
[0006]目前尚没有有效的红球菌无细胞蛋白质合成的系统。而建立红球菌无细胞蛋白质合成系统不仅可扩展当前的CFPS库，还可利用红球菌无细胞蛋白表达体系搭建高通量酶库筛选平台，加快高性能酶筛选，同时该体系的建立可扩展红球菌在合成生物学领域的应用。例如快速蛋白质合成、遗传电路原型和代谢途径构建，快速高效生产有价值的化学品和材料等。如何建立有效的红球菌无细胞蛋白质合成的系统是需要解决的问题。
技术实现思路
[0007]无细胞蛋白质合成(CFPS)系统是蛋白质合成和生物学应用的强大平台，红球菌在
制药、环境和工业领域具有相当重要的意义，被认为是制造化学品的微生物平台之一。虽然已有一些报道的CFPS系统，但其蛋白表达量很低，难以实际应用，并且这些系统不一定适合红球菌基因的表达。而目前并没有可用的红球菌CFPS系统，这限制了红球菌的应用。红球菌存在较厚的细胞壁，且蛋白表达过程中对培养基营养成分要求较高，这都为红球菌CFPS系统的开发增加了难度。本专利技术通过探索研究，其目的是开发一种基于红球菌细胞提取物的CFPS系统，提升蛋白表达水平从而扩展当前的CFPS库，进而扩展红球菌在合成生物学领域的应用。例如快速蛋白质合成、遗传电路原型和代谢途径构建，快速高效生产有价值的化学品和材料等。
[0008]本专利技术首先提供一种用于无细胞蛋白质合成系统的红球菌细胞提取物的制备方法，其包括如下步骤：（1）红球菌的培养，采用发酵培养基发酵培养红球菌，其发酵培养基成分如下：葡萄糖 10~50 g、酵母粉1~10 g、蛋白胨1~8 g、麦芽提取物1~8 g、磷酸氢二钾 0.1~1 g、磷酸二氢钾0.1~1 g、硫酸镁 0.5~3 g、尿素0.5~3 g、水定容至1 L，pH 7.2，115℃ 20 min。
[0009]（2）菌体收集：当发酵培养到菌体的OD
600
在1.9~3.1收集菌体；并且调整菌体浓度为0.6~0.8 g/mL；（3）菌体破碎：采用超声破菌，超声条件是功率50%，超声2 s，间隔6 s，共6~8 min，得到细胞提取物；其中，在超声前添加甘油或在超声后添加二硫苏糖醇。
[0010]优选地，第（3）步中在超声前加10%甘油，更优选添加量为每1 mL菌液添加10
‑
20uL 1M DTT。
[0011]本专利技术提供一种红球菌无细胞蛋白质合成的系统，其包括如下成分：（1）PEG8000的添加量： 1~2% w/v；（2）红球菌细胞提取物的添加量： 25~33%（v/v）；（3）DNA模版的添加量：12~18 ng/uL质粒；（4）RNA酶抑制剂的添加量：0.1~0.2 U/uL；（5）T7RNA聚合酶的添加量：0.6~0.8 U/uL；以及ATP、GTP、UTP和CTP，亚叶酸，20种标准氨基酸，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；辅酶A；亚精胺；腐胺；草酸钠；谷氨酸钾；谷氨酸铵；谷氨酸镁；HEPES；磷酸烯醇丙酮酸。
[0012]优选地，其中下述成分的添加量至终浓度为：ATP 1.2 mM；GTP、UTP和CTP各0.80
‑
0.90 mM；30
‑
40 μg/mL亚叶酸；2
‑
6 ng/μL质粒；20种标准氨基酸各2.5
‑
3.5 mM；0.30
‑
0.36 mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；0.25
‑
0.30 mM 辅酶A；1.0
‑
2.0 mM亚精胺；0.5
‑
1.5 mM腐胺；2
‑
6 mM草酸钠；280
‑
300 mM谷氨酸钾；8
‑
12 mM谷氨酸铵；4
‑
8 mM谷氨酸镁；50
‑
60 mM pH 7.2的HEPES；65
‑
70 mM磷酸烯醇丙酮酸。
[0013]更优选地，各成分的添加量至终浓度为：ATP 1.2 mM；GTP、UTP和CTP各0.85 mM；34 μg/mL亚叶酸；4 ng/μL质粒；0.2 U/uL T7RNA聚合酶；0.1 U/uL RNA酶抑制剂；20种标准氨基酸各3 mM；0.33 mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；0.27 mM 辅酶A；1.5 mM亚精胺；1 mM腐胺；4 mM草酸钠；290 mM谷氨酸钾；10 mM谷氨酸铵；6 mM谷氨酸镁；57 mM pH 7.2的HEPES；67 mM磷酸烯醇丙酮酸和33%的红球菌细胞提取物。
[0014]进一步优选地，所述红球菌细胞提取物是由所述的方法制备得到；本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于无细胞蛋白质合成系统的红球菌细胞提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）红球菌的培养，采用发酵培养基发酵培养红球菌，其发酵培养基成分如下：葡萄糖 10~50 g、酵母粉1~10 g、蛋白胨1~8 g、麦芽提取物1~8 g、磷酸氢二钾 0.1~1 g、磷酸二氢钾0.1~1 g、硫酸镁 0.5~3 g、尿素0.5~3 g、水定容至1 L，pH 7.2，115℃ 20 min；（2）菌体收集：当发酵培养到菌体的OD
600
在1.9~3.1收集菌体；并且调整菌体浓度为0.6~0.8 g/mL；（3）菌体破碎：采用超声破菌，超声条件是功率50%，超声2 s，间隔6 s，共6~8 min，得到细胞提取物；其中，在超声前添加甘油或在超声后添加二硫苏糖醇。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，第（3）步中在超声前加10%甘油。3.一种红球菌无细胞蛋白质合成的系统，其特征在于，包括如下成分：（1）PEG8000的添加量： 1~2% w/v；（2）红球菌细胞提取物的添加量： 25~33%（v/v）；（3）DNA模版的添加量：12~18 ng/uL质粒；（4）RNA酶抑制剂的添加量：0.1~0.2 U/uL；（5）T7RNA聚合酶的添加量：0.6~0.8 U/uL；以及ATP、GTP、UTP和CTP，亚叶酸，20种标准氨基酸，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；辅酶A；亚精胺；腐胺；草酸钠；谷氨酸钾；谷氨酸铵；谷氨酸镁；HEPES；磷酸烯醇丙酮酸；所述红球菌细胞提取物是由如权利要求1或2所述的方法制备得到。4.如权利要求3所述的系统，其特征在于，其中下述成分的添加量至终浓度为：ATP 1.2 mM；GTP、UTP和CTP各0.80
‑
0.90 mM；30
‑
40 μg/mL亚叶酸；2
‑
6 ng/μL质粒；20种标准氨基...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱柳杨，张晓立，毕悦欣，李华珍，章家泉，
申请(专利权)人：百葵锐天津生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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