一种苯丙氨酸酶的高通量筛选纯化方法及其比酶活的测定方法技术

本发明专利技术提供了一种苯丙氨酸酶的高通量筛选纯化方法及其比酶活的测定方法，应用优化后的裂解液对大肠杆菌胞内表达蛋白进行裂解，并将充分裂解的裂解液上清采用磁珠法进行纯化，最后得到了高通量的测定苯丙氨酸酶比酶活的筛选方法。本发明专利技术发展了一种快速且稳定的PAL比酶活高通量的筛选方法，传统的PAL比酶活筛选耗时5天，并且最多可获得3~4突变体的比酶活数据，然而经过改良后的PAL比酶活筛选工艺实际耗时2天，并且可获得大量的比酶活数据，简化了传统工艺中多步酶活测定和放大工艺过程。保证了PAL酶活的准确性且具有一定的平行性，从而也大大减弱了传统工艺的冗杂步骤。而也大大减弱了传统工艺的冗杂步骤。而也大大减弱了传统工艺的冗杂步骤。

【技术实现步骤摘要】
一种苯丙氨酸酶的高通量筛选纯化方法及其比酶活的测定方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种苯丙氨酸酶的高通量筛选纯化方法及其比酶活的测定方法。

技术介绍

[0002]苯丙氨酸酶（phenylalaninammo－nialyase，PAL）是人体内苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）转化成酪氨酸的关键酶。PAL催化 L
‑
苯丙氨酸解氨生成反式肉桂酸，是连接初级代谢和苯丙烷类代谢、催化苯丙烷类代谢第一步反应的酶，也是苯丙氨酸代谢途径的关键酶和限速酶。一切含苯丙烷骨架的物质都由该代谢途径直接或间接生成。该酶在不同生物体中具有不同的氨基酸编码、组织分布和催化活性。研究苯丙氨酸酶基因，对相关代谢通路认知、反式肉桂酸生产有着重要的意义。
[0003]通常情况下，定义苯丙氨酸酶在1分钟(min)内转化苯丙氨酸生成1μmol反式肉桂酸所需的酶量为1酶活单位，即1U；定义单位质量(1mg)的酶所具有的酶活为比酶活，单位U/mg。由于苯丙氨酸和反式肉桂酸具有不同的吸光特性，在290nm下，肉桂酸具有苯丙氨酸不具备的强烈吸收峰，因此可以通过测量290nm处的吸光值增加量计算苯丙氨酸酶酶活。
[0004]传统的PAL比酶活筛选步骤包括：PAL突变体的胞内蛋白表达、总酶活测定、蛋白纯化、PAL纯酶酶活测定以及比酶活计算；从PAL组合突变库挑选不同的突变体，利用96深孔板进行蛋白表达，收集菌体，使用常规裂解方法对细胞进行裂解，离心后获得的PAL粗酶液；进一步测定PAL总酶活，达到对PAL的初步筛选；选择PAL总酶活高于野生型总酶活的菌株进行摇瓶扩大培养，收集菌体；利用超声破碎仪破碎细胞，收集破碎上清；进一步使用蛋白纯化仪对破碎上清液进行镍柱纯化，收集目的蛋白，目的蛋白超滤脱盐处理；利用A280法对蛋白进行定量，测定PAL纯酶的酶活，从而计算PAL比酶活。然而，传统的PAL比酶活筛选中，应用常规的裂解液（含有DTT）裂解细胞，不同批次处理获得的PAL酶稳定性较差；而且基于总酶活进行初步筛选，不能判断是否是由于蛋白表达量的不同而造成比酶活不同的差异；传统工艺中会采用超声破碎进行细胞裂解，由于仪器等的不稳定性，会造成粗酶液制备的差异性，导致后期比酶活计算的差异，并且传统工艺中，蛋白纯化时很难进行通量纯化，导致蛋白长时间放置，影响PAL酶活。传统工艺步骤冗杂，需要进行多次PAL酶活测定。
[0005]为了克服上述问题，本专利技术提供一种基于快速且大量裂解PAL酶的裂解液配方，一种结合磁珠进行蛋白高通量纯化方法，结合使用吸光值测定反式肉桂酸的浓度获得纯酶的酶活，保证了PAL酶活的准确性且具有一定的平行性，从而也大大减弱了传统工艺的冗杂步骤。同时，由于所需菌体及试剂量少且磁珠可以方便的分离，该方法能够很好的借助自动移液工作站或自动化磁吸式核酸提取仪实现极高通量的全自动化筛选。

技术实现思路

[0006]为解决现有技术中对苯丙氨酸酶酶活性的测定的不足，本专利技术涉及一种苯丙氨酸
酶的高通量筛选纯化方法及其比酶活的测定方法。提供了一种苯丙氨酸酶的高通量筛选纯化方法及其比酶活的测定方法，应用优化后的裂解液对大肠杆菌胞内表达蛋白进行裂解，并将充分裂解的裂解液上清采用磁珠法进行纯化，最后得到了高通量的测定苯丙氨酸酶比酶活的筛选方法。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术公开了一种苯丙氨酸酶的高通量筛选纯化及其比酶活的测定方法，包括如下步骤：1）将不同的含有苯丙氨酸酶（PAL）突变体的大肠杆菌进行蛋白表达，细胞裂解，获得粗酶液；2）采用磁珠法对 PAL不同突变体蛋白进行高通量纯化，作为待测样品；3）对所述待测样品进行蛋白定量获得酶浓度；4）将所述待测样品与底物苯丙氨酸和缓冲液MES混合，记录290nm条件下，反应一段时间前后的吸光度的差值，计算酶活值，其中，，吸光系数k为吸光度与反式肉桂酸浓度标准曲线系数；5）计算比酶活，其中，。
[0008]优选的，步骤1）中的蛋白表达于96深孔板进行。
[0009]优选的，步骤1）中的所述细胞裂解采用的细胞裂解液配方为50 mM Tris
‑
HCl，150 mM NaCl，100 mM EDTA，10% Triton X
‑
100，20 mg/ml溶菌酶。
[0010]优选的，步骤1）中的大肠杆菌是以苯丙氨酸酶（PAL）基因序列为模板，利用易错PCR手段构建。
[0011]优选的，步骤2）中的纯化操作包括：磁珠的清洗，磁珠活化，目的蛋白与磁珠的结合，磁珠的洗涤，目的蛋白的洗脱。
[0012]优选的，步骤2）中的纯化操作为：于新的96深孔板中，每孔加入50 μl磁珠，用纯化水清洗磁珠2次，用Buffer A进行磁珠活化，弃上清；将所述粗酶液100 μl分别加入含有磁珠的96孔板中，漩涡混合，磁珠分离，将含不同咪唑浓度的buffer A加入96孔板中，洗涤两次，磁珠分离；用150 μl含有300 mM咪唑浓度的buffer A洗脱目的蛋白，作为待测样品，所述Buffer A配方为20 mM PB， 500 mM NaCl，pH7.4。
[0013]优选的，步骤2）中的磁珠为镍磁珠。
[0014]优选的，所述不同咪唑浓度分别为10 mM、30 mM、60 mM咪唑浓度。
[0015]优选的，所述磁珠分离操作中采用磁铁放置孔板底部，倒扣式弃上清液。
[0016]优选的，步骤3）中的定量方法为Bradford法。
[0017]优选的，步骤3）中的定量方法中采用牛血清白蛋白制备标准曲线。
[0018]优选的，步骤4）中的MES的浓度为150mM，pH6.0。
[0019]本专利技术目的在于提供一种PAL比酶活的高通量测定方法。
[0020]本专利技术第一方面，提供一种对PAL酶进行比酶活的高通量筛选方法，所述方法包
括：（1）以苯丙氨酸酶（PAL）基因序列为模板，利用易错PCR手段构建PAL突变库，挑选不同突变体，应用96深孔板进行蛋白表达，细胞裂解，获得粗酶液；（2）采用磁珠法对 PAL不同突变体进行高通量纯化，并应用磁铁吸附技术改进了高通量纯化过程中蛋白均一性问题；（3）应用Bradford法对PAL纯酶进行蛋白定量获得酶浓度；（4）将所述待测样品与底物苯丙氨酸和缓冲液MES混合，记录290nm条件下，反应一段时间前后的吸光度的差值，计算酶活值，其中，，吸光系数k为吸光度与反式肉桂酸浓度标准曲线系数；（5）计算比酶活，其中，。
[0021]优选地，步骤（1）中，所述的蛋白为大肠杆菌胞内表达；优选地，步骤（1）中，所述的细胞裂解中，裂解液配方是50 mM Tris
‑
HCl，150 mM NaCl，100 mM EDTA，10% Triton X
‑
100，20 mg/ml溶菌酶。
[0022]优选地，步骤（2）中，高通量纯化过程中包括96孔板，含有镍填料的磁珠，磁铁。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种苯丙氨酸酶的高通量筛选纯化及其比酶活的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：1）将不同的含有苯丙氨酸酶突变体的大肠杆菌进行蛋白表达，细胞裂解，获得粗酶液；2）采用磁珠法对不同苯丙氨酸酶突变体进行高通量纯化，作为待测样品；3）对所述待测样品进行蛋白定量获得酶浓度；4）将所述待测样品与底物苯丙氨酸和缓冲液MES混合，记录290nm条件下，反应一段时间前后的吸光度的差值，计算酶活值，其中，，吸光系数k为吸光度与反式肉桂酸浓度标准曲线系数；5）计算比酶活，其中，。2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤1）中的蛋白表达于96深孔板进行。3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤1）中的所述细胞裂解采用的细胞裂解液配方为50 mM Tris
‑
HCl，150 mM NaCl，100 mM EDTA，10% Triton X
‑
100，20 mg/ml溶菌酶。4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤2）中的纯化操作包括：磁珠的清洗，磁珠活化，目的蛋白与磁珠的结合，磁珠的洗涤，目的蛋白的洗脱。5.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟翔宇，柴成程，李瑞琦，李华珍，章家泉，
申请(专利权)人：百葵锐天津生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：