一种突变型信号肽及含有该突变型信号肽的重组载体和应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，尤其涉及一种突变型信号肽及含有该突变型信号肽的重组载体和应用。所述突变型信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2。本发明专利技术在野生型信号肽的基础上，将野生型信号肽第2位氨基酸由E突变为K、第4位氨基酸由D突变为K，得到突变型信号肽，该信号肽的N端区域所带正电荷明显增加，穿膜能力强，可实现核膜蛋白如TMEM176B的分泌表达，并提高该蛋白的分泌水平，为其他细胞核膜蛋白分泌表达的信号肽序列提供了参考依据。达的信号肽序列提供了参考依据。达的信号肽序列提供了参考依据。

【技术实现步骤摘要】
一种突变型信号肽及含有该突变型信号肽的重组载体和应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，特别涉及一种突变型信号肽及含有该突变型信号肽的重组载体和应用。

技术介绍

[0002]真核细胞的核膜是由内核膜和外核膜组成的双层膜状结构，其可以分隔细胞核与细胞质，保护细胞核内的遗传物质，并维持细胞正常活动所需的机械特性。超过60种核膜蛋白定位于内外核膜上，对修饰核膜以及保证核膜的完整性具有重要作用，且核膜蛋白在染色质组织、基因调控、信号转导等方面均具有重要的生物学意义。研究发现，编码不同核膜蛋白的基因若发生突变，将会引起一系列严重的核膜相关疾病。跨膜蛋白176B(TMEM176B)和跨膜蛋白176A(TMEM176A)属于跨膜4A(MS4A)蛋白家族，均对树突细胞成熟有抑制作用。TMEM176A和TMEM176B在人类多种组织之间的表达存在明显差异，二者的表达水平与多种肿瘤组织存在显著关联，因此，TMEM176A与TMEM176B蛋白的比例有望成为淋巴瘤、黑色素瘤、乳腺肿瘤和肝脏肿瘤等的生物学标志物和治疗靶点。尽管针对核膜蛋白如TMEM176B和TMEM176A的研究取得了一定进展，但是这类蛋白的生理功能至今仍未阐明。一方面，这类蛋白由于定位于细胞核膜，其获取和分离纯化较为困难，另一方面，其跨膜结构阻碍了该蛋白的体外重组，使其体外重组分泌表达难度较大，无法获得高质量的蛋白，继而无法进行相关功能研究或者开发具有诊断功能的抗体。因此，利用基因工程等手段实现核膜蛋白的分泌的表达对于蛋白功能研究及应用至关重要。
专利技术内容
[0003]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种突变型信号肽，并提供了含有该突变型信号肽的重组载体以及该重组载体在分泌蛋白表达领域的应用，以解决现有技术中核膜蛋白难以分泌表达和无法有效获得高浓度核膜蛋白的技术问题。
[0004]本专利技术具体通过以下技术方案实现：
[0005]本专利技术的第一方面提供了一种突变型信号肽，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2。
[0006]本专利技术的第二方面提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如上所述的突变型信号肽。
[0007]进一步地，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO：3所示。
[0008]本专利技术的第三方面提供了一种重组载体，所述重组载体包括如上所述的编码突变型信号肽的多核苷酸以及包括编码核膜蛋白的多核苷酸，所述编码突变型信号肽的多核苷酸紧接在所述编码核膜蛋白的多核苷酸的5
’
端。
[0009]进一步地，所述核膜蛋白为TMEM176B蛋白148
‑
208aa，其DNA序列如SEQ ID NO：5所示。
[0010]进一步地，所述重组载体还包括编码蛋白标签的多核苷酸，所述编码蛋白标签的
多核苷酸紧接在所述编码核膜蛋白的多核苷酸的3
’
端。
[0011]进一步地，所述蛋白标签包括依次连接的mFC和6
×
His，其DNA序列如SEQ ID NO：7所示。
[0012]本专利技术第四方面提供了一种分泌蛋白的制备方法，包括以下步骤：
[0013]S1、将编码突变型信号肽的多核苷酸序列和编码核膜蛋白的多核苷酸序列连接到表达载体上，经测序验证，获得重组载体；
[0014]S2、将所述重组载体转染进真核细胞，培养一段之后，收获转染后的真核细胞，并收集上清液进行纯化，得到所述分泌蛋白。
[0015]进一步地，步骤S1中，所述编码突变型信号肽的DNA序列如SEQ ID NO：3所示，所述编码核膜蛋白的DNA序列如SEQ ID NO：5所示，所述表达载体包括pCDNA3.4。
[0016]进一步地，步骤S2中，采用瞬时转染技术将所述重组载体转染进真核细胞，所述真核细胞包括HEK293F细胞。
[0017]本专利技术第五方面提供了一种分泌蛋白，由如上所述的分泌蛋白的制备方法制备得到，所述分泌蛋白包括核膜蛋白和蛋白标签。
[0018]进一步地，所述核膜蛋白为TMEM176B蛋白148
‑
208aa，所述蛋白标签包括依次连接的mFC和6
×
His。
[0019]本专利技术的优点及积极效果为：
[0020]本专利技术在野生型信号肽的基础上，将野生型信号肽第2位氨基酸由E突变为K、第4位氨基酸由D突变为K，得到突变型信号肽，该信号肽的N端区域所带正电荷明显增加，穿膜能力强，可实现核膜蛋白如TMEM176B的分泌表达，并提高该蛋白的分泌水平，为其他细胞核膜蛋白分泌表达的信号肽序列提供了参考依据。
附图说明
[0021]为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0022]图1为本专利技术实施例的构建质粒1时的菌落PCR鉴定结果图；
[0023]图2为本专利技术实施例的构建质粒2时的反向扩增质粒1的PCR鉴定结果图；
[0024]图3为本专利技术实施例的质粒1和质粒2转染真核细胞后的细胞培养浓度随时间变化图；
[0025]图4为本专利技术实施例的质粒1和质粒2转染真核细胞后的细胞存活率随时间变化图；
[0026]图5为本专利技术实施例的质粒1和质粒2转染真核细胞后采用WB验证的蛋白表达图；
[0027]图6为本专利技术实施例的质粒1转染真核细胞后的蛋白纯化图；
[0028]图7为本专利技术实施例的质粒2转染真核细胞后的蛋白纯化图。
具体实施方式
[0029]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本专利技术
进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0030]根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本专利技术的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本专利技术的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本专利技术的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本专利技术实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
[0031]为了更好地理解本专利技术而不是限制本专利技术的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
[0032]为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本专利技术的具体实施例做详细说明。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种突变型信号肽，其特征在于，所述突变型信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2。2.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1所述的突变型信号肽。3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO：3所示。4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包括如权利要求2或3所述的多核苷酸以及包括编码核膜蛋白的多核苷酸，如权利要求2或3所述的多核苷酸紧接在所述编码核膜蛋白的多核苷酸的5
’
端。5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述核膜蛋白为TMEM176B蛋白148
‑
208aa，其DNA序列如SEQ ID NO：5所示。6.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体还包括编码蛋白标签的多核苷酸，所述编码蛋白标签的多核苷酸紧接在所述编码核膜蛋白的多核苷酸的3
’
端。7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于，所述蛋白标签包括依次连接的mF...

【专利技术属性】
技术研发人员：余乐，程威，刘佩佩，程昊，
申请(专利权)人：优睿赛思武汉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：