一种与人表皮生长因子受体-2特异性结合的靶向多肽H-5的制备与应用制造技术

本发明专利技术公开了与人表皮生长因子受体

【技术实现步骤摘要】
一种与人表皮生长因子受体
‑
2特异性结合的靶向多肽H
‑
5的制备与应用


[0001]本专利技术属于蛋白质多肽
，具体涉及一种与人表皮生长因子受体
‑
2特异性结合的靶向多肽H
‑
5的制备与应用。

技术介绍

[0002]人表皮生长因子受体
‑
2(human epidermal growth factor receptor
‑
2,HER2)基因即酪氨酸激酶受体2(Erb
‑
B2receptor tyrosine kinase 2,ERBB2)基因，位于人17号染色体q12
‑
21，编码相对分子质量为185000的跨膜受体样蛋白。人类表皮因子受体家族包括四种RTKs跨膜蛋白受体，其中HER2与肿瘤的关系最为密切。HER2表达增加后，其下游分子FOXM1(forkhead box M1)、Akt等表达也增加，FOXM1、Akt分子与很多肿瘤相关，这说明HER2途径与许多肿瘤的关系非常密切，很多文献证实了这一点。HER2蛋白可以促进血管生成，增加血管通透性，为肿瘤提供丰富营养，从而显著增强肿瘤的侵袭能力。
[0003]噬菌体展示技术(phage display technology)是20世纪80年代逐步建立并发展起来的一项分子生物学新技术。它以噬菌体或噬粒为载体，使外源肽或蛋白质的基因与噬菌体表面特定蛋白质基因在其表面进行融合表达，进而通过亲和富集法筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体。噬菌体随机展示肽库技术是把随机短肽片段与噬菌体的P3或P8基因的N端进行融合，通过展示技术让随机短肽得以独立表达并具有生物学功能。噬菌体肽库技术是一种新兴的药物发现工具，通过噬菌体随机肽库筛选获得的肽可以作为分子载体运载药物，起到生物导弹的功能。筛选的肽也可以直接与药物靶点分子特异性结合，起到生物治疗的作用。
[0004]因此，制备出能够特异性结合人表皮生长因子受体
‑
2的多肽，对于癌症的检测、抗原表位分析、肿瘤细胞信号转导、肿瘤药物的研制及肿瘤基因治疗的研究具有十分重要的意义。

技术实现思路

[0005]为解决现有技术的不足，本专利技术的目的在于一种与人表皮生长因子受体
‑
2特异性结合的靶向多肽H
‑
5的制备与应用
[0006]为了实现上述目标，本专利技术采用如下的技术方案：
[0007]一种与人表皮生长因子受体
‑
2特异性结合的靶向多肽H
‑
5，多肽H
‑
5的氨基酸序列为Thr
‑
Pro
‑
Ala
‑
Tyr
‑
Trp
‑
Glu
‑
Phe
‑
Asn
‑
Asp
‑
Pro
‑
Ser
‑
Thr
‑
Arg。
[0008]优选地，多肽H
‑
5的分子量为1582.7052。
[0009]优选地，多肽H
‑
5通过噬菌体展示技术筛选获得。
[0010]一种与人表皮生长因子受体
‑
2特异性结合的靶向多肽H
‑
5的筛选方法，包括以下步骤：
[0011]S1、噬菌体展示固相淘选：用包被液稀释人表皮生长因子受体
‑
2蛋白，进行吸附、
洗脱处理，得到含有高亲和力噬菌体的洗脱液；
[0012]S2、噬菌体滴度测定与扩增：对洗脱液进行滴度测定并扩增，得到扩增后的洗脱液，用于下一轮筛选；重复三轮“吸附
‑
洗脱
‑
扩增”筛选，得到筛选出的阳性噬菌体；
[0013]S3、ELISA鉴定：对筛选出的阳性噬菌体进行ELISA鉴定；
[0014]S4、DNA提取与测序：DNA测序分析推导出对应的多肽编码，依据中心法则推导多肽序列，即筛选到最佳阳性肽H
‑
5。
[0015]一种与人表皮生长因子受体
‑
2特异性结合的靶向多肽H
‑
5的固相合成方法，包括以下步骤：
[0016](1)树脂的溶胀：将二氯树脂置于多肽反应管中，经DCM溶胀；
[0017](2)Fmoc保护的脱除：向多肽反应管中加入哌啶/DMF溶液，振摇、抽滤去溶液；
[0018](3)氨基酸的连接：称取Fmoc
‑
Thr(tBu)
‑
OH和HCTU于离心管中，加入DMF溶解，再加入DIPEA，将其倒入多肽反应管中，振摇；重复步骤(2)和上述步骤，依次连接所有氨基酸；
[0019](4)多肽的树脂解离和侧链保护脱除：向多肽反应管中加入切割试剂，反应结束后，收集滤液，沉淀得到粗肽；
[0020](5)粗肽的纯化：对粗肽进行采用反相HPLC纯化，纯化完毕后，收集到的液体进行冻干，得到白色冻干粉末。
[0021]优选地，步骤(4)中，依次进行连接的氨基酸是：Fmoc
‑
Pro
‑
OH，Fmoc
‑
Ala
‑
OH，、Fmoc
‑
Tyr(tBu)
‑
OH，Fmoc
‑
Trp(Boc)
‑
OH，Fmoc
‑
Glu(OtBu)
‑
OH，Fmoc
‑
Phe
‑
OH，Fmoc
‑
Asn(Trt)
‑
OH，Fmoc
‑
Asp(OtBu)
‑
OH，Fmoc
‑
Pro
‑
OH，Fmoc
‑
Ser(tBu)
‑
OH，Fmoc
‑
Thr(tBu)
‑
OH，Fmoc
‑
Arg(pbf)
‑
OH。
[0022]优选地，切割试剂包括以下按体积比计的各组分：TFA：TIPs：水＝95：2.5：2.5。
[0023]靶向多肽H
‑
5在人表皮生长因子受体
‑
2蛋白相关疾病的早期诊断、靶向成像以及治疗系统中的应用。
[0024]本专利技术的有益之处在于：
[0025](1)本专利技术首先进行噬菌体展示固相淘选、噬菌体滴度测定与扩增、重复3轮“吸附
‑
洗脱
‑
扩增”淘选、ELISA鉴定噬菌体单克隆与人表皮生长因子受体
‑
2蛋白的亲和力，最后进行DNA提取与测序，通过亲和力筛选可获得最佳的与人表皮生长因子受体
‑
2蛋白特异性结本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种与人表皮生长因子受体
‑
2特异性结合的靶向多肽H
‑
5，其特征在于，所述多肽H
‑
5的氨基酸序列为Thr
‑
Pro
‑
Ala
‑
Tyr
‑
Trp
‑
Glu
‑
Phe
‑
Asn
‑
Asp
‑
Pro
‑
Ser
‑
Thr
‑
Arg。2.根据权利要求1所述的一种与人表皮生长因子受体
‑
2特异性结合的靶向多肽H
‑
5，其特征在于，所述多肽H
‑
5的分子量为1582.7052。3.根据权利要求1所述的一种与人表皮生长因子受体
‑
2特异性结合的靶向多肽H
‑
5，其特征在于，所述多肽H
‑
5通过噬菌体展示技术筛选获得。4.权利要求1所述的一种与人表皮生长因子受体
‑
2特异性结合的靶向多肽H
‑
5的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、噬菌体展示固相淘选：用包被液稀释人表皮生长因子受体
‑
2蛋白，进行吸附、洗脱处理，得到含有高亲和力噬菌体的洗脱液；S2、噬菌体滴度测定与扩增：对洗脱液进行滴度测定并扩增，得到扩增后的洗脱液，用于下一轮筛选；重复三轮“吸附
‑
洗脱
‑
扩增
”ꢀ
筛选，得到筛选出的阳性噬菌体；S3、ELISA鉴定：对筛选出的阳性噬菌体进行ELISA鉴定；S4、DNA提取与测序：DNA测序分析推导出对应的多肽编码，依据中心法则推导多肽序列，即筛选到最佳阳性肽H
‑
5。5.权利要求1所述的一种与人表皮生长因子受体
‑
2特异性结合的靶向多肽H
‑
5的固相合成方法，其特征在于，包括以下步骤：树脂的溶胀：将二氯树脂置于多肽反应管中，经DCM溶胀；Fmoc保护的脱除：向多肽反应管中加入哌啶/DMF溶液，振摇、抽滤去溶液；...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘超，胡勇，
申请(专利权)人：江苏科缔思生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：