高细胞选择性的色氨酸和精氨酸富集的抗菌肽WRT6及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开一种高细胞选择性的色氨酸和精氨酸富集的抗菌肽WRT6及其制备方法和应用，属于生物技术领域。抗菌肽WRT6的氨基酸序列，如SEQ ID No.1所示。制备方法：通过引入亲水性不带电荷苏氨酸并结合疏水性色氨酸和亲水性带电荷精氨酸，根据抗菌肽的构效关系设计得到高细胞选择性色氨酸和精氨酸富集抗菌肽WRT6，然后通过固相合成法合成。抗菌肽WRT6作为制备治疗由革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌引发的感染性疾病的药物中的应用。抗菌肽WRT6对多种细菌具有强效的抑菌活性，而且细胞毒性低，所以细胞选择性指数高达61.05，具有极高的应用潜力。力。力。

【技术实现步骤摘要】
高细胞选择性的色氨酸和精氨酸富集的抗菌肽WRT6及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种高细胞选择性的色氨酸和精氨酸富集的抗菌肽WRT6及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]抗生素在医疗、食品、畜牧等领域发挥了重要作用，但抗生素长期大规模、高剂量的滥用带来的病原微生物耐药性、环境污染等问题严重限制了其发展前景，甚至已经严重危机人类和动物的健康，成为全球性的公共问题。因此研发绿色、安全、高效的抗生素替代产品成为当务之急。抗菌肽作为宿主免疫系统的重要组成部分，不仅具有抗细菌、抗真菌、免疫调节等多种生物学功能，而且与传统抗生素主要作用于胞内靶点不同，大多数的抗菌肽通过以膜裂解为主的多重作用机理杀死细菌，这种多重作用机理不易使细菌产生耐药性，所以具有替代抗生素的巨大潜力。
[0003]近年来，抗菌肽的极简化全新设计策略被提出并引起了广泛关注。在该设计策略中，疏水性氨基酸色氨酸和亲水性带电荷氨基酸精氨酸的组合被誉为是最经典和最有效的“黄金搭档”。因为与其他疏水性氨基酸相比，色氨酸独特的吲哚侧链被认为促进了抗菌肽与脂质双分子层之间的界面缔合，并在膜破裂过程中介导了与脂质酰基链的内聚疏水相互作用。而与其他亲水性带电荷氨基酸相比，精氨酸的胍基侧链对带有负电荷组分的细胞膜具有更强的静电吸引力。尽管这种组合可以赋予抗菌肽强大的抗菌活性，但同时也会导致严重的溶血和细胞毒性，使其丧失细菌细胞和哺乳动物细胞之间的细胞选择性，这极大地限制了其应用潜力。因此如何在不减弱抗菌活性的同时减小细胞毒性成为亟需攻克的难题。

技术实现思路

[0004]基于以上不足之处，本专利技术的目的在于提供一种高细胞选择性的色氨酸和精氨酸富集的抗菌肽WRT6，解决了色氨酸和精氨酸富集抗菌肽细胞选择性低的问题。
[0005]本专利技术所采用的技术方案如下：一种高细胞选择性的色氨酸和精氨酸富集抗菌肽WRT6，其氨基酸序列如SEQ NO.1所示，其C端采用氨基酰胺化，分子式如式(Ⅰ)所示：
[0006][0007]本专利技术的另一目的是提供如上所述的一种高细胞选择性的色氨酸和精氨酸富集的抗菌肽WRT6的制备方法，步骤如下：
[0008](1)选择具有独特吲哚侧链的色氨酸作为疏水性氨基酸来提供必要的疏水性，同时增强多肽与脂质双分子层之间的相互作用；
[0009](2)选择具有胍基侧链的精氨酸作为阳离子氨基酸来提供必要的净正电荷，同时增强多肽与膜表面负电荷组分之间的静电作用；
[0010](3)在色氨酸和精氨酸的C端侧放置苏氨酸，通过调节亲水性和疏水性之间的平衡，减小色氨酸和精氨酸富集抗菌肽的细胞毒性，提高其细胞选择性；
[0011](4)设计出多肽序列的模版为：(WRX)
n
‑
NH2，当X＝T，n＝6时，其氨基酸序列如SEQ NO.1所示；
[0012](5)采抗菌肽的制备采用固相化学合成法，使用多肽合成仪合成多肽树脂，然后经过三氟乙酸切割后，经过反相高效液相色谱纯化，然后将得到的多肽经过质谱鉴定，得到该多肽，经过抑菌活性的测定和细胞毒性的测定，最后将该多肽命名为抗菌肽WRT6。
[0013]本专利技术的另一目的是提供如上所述的一种高细胞选择性色氨酸和精氨酸富集抗菌肽WRT6作为制备治疗由革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌引发的感染性疾病的药物中的应用。
[0014]进一步的，所述革兰氏阴性菌为大肠杆菌、绿脓杆菌、鼠伤寒沙门氏菌或猪霍乱沙门氏菌。
[0015]进一步的，所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌。
[0016]本专利技术具有如下优点及有益效果：本专利技术通过引入苏氨酸，而无需进行复杂的化学修饰或非天然氨基酸取代即可提高色氨酸和精氨酸富集抗菌肽的细胞选择性；对制备的抗菌肽WRT6进行抑菌活性和细胞毒性测定，发现WRT6对大肠杆菌、绿脓杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等多种细菌都有强效的抑制作用，对红细胞、巨噬细胞、肾上皮细胞、肠上皮细胞几乎没有毒性，具有较高的应用价值，选择性指数高达61.05，具有极大的应用潜力。
附图说明
[0017]图1抗菌肽WRT6的反相高效液相色谱图。
[0018]图2抗菌肽WRT6的质谱图。
具体实施方式
[0019]下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。
[0020]实施例1
[0021]抗菌肽的设计
[0022]选择具有独特吲哚侧链的色氨酸作为疏水性氨基酸来提供必要的疏水性，同时增强抗菌肽与脂质双分子层之间的相互作用；选择具有胍基侧链的精氨酸作为阳离子氨基酸来提供必要的净正电荷，同时增强抗菌肽与膜表面负电荷组分之间的静电作用；在色氨酸和精氨酸的C端侧放置苏氨酸，通过调节亲水性和疏水性之间的平衡，以减小色氨酸和精氨酸富集抗菌肽的细胞毒性，从而提高其细胞选择性。基于上述技术方案设计的高细胞选择性的抗菌肽序列模版为：(WRX)
n
‑
NH2，当X＝T，n＝6时，抗菌肽命名为WRT6。当移除序列中的
苏氨酸，序列中仅包含色氨酸和精氨酸时作为对照抗菌肽，即(WR)
n
‑
NH2，当n＝6时，对照抗菌肽命名为WR6。
[0023]抗菌肽WRT6的氨基酸序列如下：
[0024][0025]抗菌肽WR6的氨基酸序列如下：
[0026][0027]表1肽的氨基酸序列
[0028][0029]实施例2
[0030]固相化学合成法合成抗菌肽
[0031]1.抗菌肽的合成通过多肽合成仪从C端到N端逐一进行。首先将Fmoc
‑
X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X
‑
Wang树脂；再将Fmoc
‑
Y
‑
Trt
‑
OH(9
‑
芴甲氧羧基
‑
三甲基
‑
Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；
[0032]2.在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2小时，过滤；沉淀三氟乙酸洗涤，然后将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，
‑
20℃沉淀3小时，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由三氟乙酸、水和三异丙基氯硅烷按照质量比95:2.5:2.5混合而成；
[0033]3.使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸pH＝7.4)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高细胞选择性色氨酸和精氨酸富集抗菌肽WRT6，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ NO.1所示，其C端采用氨基酰胺化，分子式如式(Ⅰ)所示：2.根据权利要求1所述的一种高细胞选择性色氨酸和精氨酸富集抗菌肽WRT6的制备方法，其特征在于，方法步骤如下：(1)选择具有独特吲哚侧链的色氨酸作为疏水性氨基酸来提供必要的疏水性，同时增强多肽与脂质双分子层之间的相互作用；(2)选择具有胍基侧链的精氨酸作为阳离子氨基酸来提供必要的净正电荷，同时增强多肽与膜表面负电荷组分之间的静电作用；(3)在色氨酸和精氨酸的C端侧放置苏氨酸，通过调节亲水性和疏水性之间的平衡，减小色氨酸和精氨酸富集抗菌肽的细胞毒性，提高其细胞选择性；(4)设计出多肽序列的模版为：(WRX)
n

【专利技术属性】
技术研发人员：单安山，穆罕默德，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：