一种角质酶突变体及其对PET高效降解的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种角质酶突变体及其对PET高效降解的应用。所述角质酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，是将SEQ ID NO.1所示的野生型角质酶的氨基酸序列第239位的苯丙氨酸替换为丙氨酸。本发明专利技术构建的角质酶突变体通过在大肠杆菌中表达，突变酶的活性与野生型酶相比，稳定性增加，催化效率提升，PET塑料(聚对苯二甲酸乙二醇酯，PET)降解产物的产量增加了42.6倍。改造后的角质酶突变体，提高PET降解效率，可降低生产成本，更适合工业应用。更适合工业应用。更适合工业应用。

【技术实现步骤摘要】
一种角质酶突变体及其对PET高效降解的应用


[0001]本专利技术属于酶工程
，具体涉及一种角质酶突变体及其对PET高效降解的应用。

技术介绍

[0002]塑料工业的迅猛发展改变了人们传统的生产、生活方式，给人们的生活带来了极大的便利，但产生的大量塑料垃圾在自然环境中不断累积，给全球的生态环境造成了严重的负担。每年有大量的塑料垃圾进入海洋生态系统，给海洋的鸟类、鱼类等生物造成了严重的生存威胁。聚对苯二甲酸乙二醇酯(Polyethylene glycol terephthalate，PET)由石油衍生的对苯二甲酸和乙二醇为材料合成，具有烃链长、分子量高、气体渗透性低、难降解等特点。因生产成本低、耐用性好和使用简便等优点，PET成为使用量最多的聚酯材料，全球一半以上的合成纤维和塑料瓶由PET制成。由于PET分子的主链上存在芳香族化合物而难以自然降解，发展PET塑料的绿色降解处理技术对于全球生态环境保护等具有重要的意义。
[0003]角质酶(Cutinase)属于α/β折叠水解酶超家族，具有丝氨酸、组氨酸、天冬氨酸残基组成的催化三联体，是目前有效降解PET的重要酶类。在酶的作用下PET被降解为对苯二甲酸乙二醇酯(BHET)、对苯二甲酸单乙二醇酯(MHET)和对苯二甲酸(TPA)，可被有效回收再利用。PET塑料的玻璃化温度为76℃，在高温下稳定的角质酶，是降解PET的重要类群。蛋白质工程改造角质酶，可明显的提高野生型酶的PET降解活力，热稳定性和环境适应潜力。海洋类诺卡氏菌Nocardioides sp.SCSIO 66511来源的角质酶ScCut，最适酶反应温度为70℃，但活性相对较低。因此，本专利通过结构分析构建了具备高活性的突变体，在环境中废PET塑料降解中表现出较好工业应用潜力。

技术实现思路

[0004]本专利技术的第一个目的是提供一种角质酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述的角质酶突变体，是在SEQ ID NO.1所述的野生型角质酶基础上，将第239位苯丙氨酸替换为丙氨酸。
[0005]本专利技术的第二个目的是提供一种编码上述角质酶突变体的编码基因。优选，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0006]本专利技术的第三个目的是提供一种含有上述编码基因的重组载体。
[0007]本专利技术的第四个目的是提供一种含有上述重组载体的重组工程菌。
[0008]优选，所述重组工程菌为大肠杆菌。
[0009]优选，所述大肠杆菌为BL21(DE3)。
[0010]本专利技术的第五个目的是提供上述角质酶突变体、上述重组载体或上述重组工程菌在PET降解中的应用。
[0011]本专利技术的第六个目的是提供一种降解PET的方法，是用上述角质酶突变体与PET进行反应。
[0012]优选，所述角质酶突变体的浓度为1mg/mL。
[0013]本专利技术通过分子对接模拟确定了角质酶与底物的结合口袋，发现了影响活性的关键氨基酸残基(239位)，通过定点突变提升了PET的催化效率，提高了降解产物的释放量。与野生型菌株相比，角质酶突变体催化产物提升了42.6倍，降解活性超过了世界最好降解活性酶之一的ICCG，在降低生产成本，提高生产效率等方面显示出更好的工业应用潜力。
[0014]诺卡氏菌Nocardioides sp.SCSIO 66511保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号CGMCC No.26044，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏日期为：2022年12月4号。
附图说明
[0015]图1是角质酶ScCut与分子MHET和BHET对接示意图；(A，与分子MHET对接图；B，与分子BHET对接图)。
[0016]图2是计算模拟野生酶与突变体结构对比示意图；(绿色为野生酶结构，蓝色为突变体结构)。
[0017]图3是PET降解产物液相检测吸收峰(野生型酶ScCut；突变酶ScCut
‑
Phe239Ala；对照酶ICCG，Control是HPLC的检测基线)。
[0018]图4是降解产物芳香族化合物对比(野生型酶ScCut；突变酶ScCut
‑
Phe239Ala；对照酶ICCG)。
具体实施方式
[0019]以下实施例中未作具体的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
[0020]在本专利技术中采用如下定义：
[0021]1.氨基酸和DNA核苷酸序列的命名法
[0022]使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字字母代码形式。DNA核苷酸序列采用公认IUPAC命名法。
[0023]2.角质酶突变体的标识，采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示ScCut突变体中突变的氨基酸。如Phe239Ala，表示位置239的氨基酸由野生型的Phe替换成Ala，位置的编号对应于SEQ ID No.1中野生型ScCut的氨基酸序列编号。
[0024]以下将结合附图和实施例对本专利技术作进一步地解释说明。
[0025]实施例1：野生型角质酶与降解产物MHET和BHET分子对接
[0026]以角质酶ScCut基因为模板，在Alpha fold 2进行蛋白结构预测，采用AutoDock4.2软件进行对接，根据结合模式发现底物结合口袋的上方有类似“盖子”的结构(图1)，阻碍了反应底物的进入。因此为了提高活性，选择对该“盖子”结构进行突变，将239位置的苯丙氨酸替换为丙氨酸后底物结合口袋明显变大(图2)。
[0027]实施例2：定点突变株的获得
[0028]以海洋类诺卡氏菌Nocardioides sp.SCSIO 66511的基因组作为模板，以SC
‑
F1(5
’‑
gga gatatacatatgGATGCACCGTGCGCGCCGCT
‑3’
),SC
‑
R1(5
’‑
ggtgctcgagGCGTGCCGCGTCGC GCAGGC
‑3’
)为引物，扩增编码ScCut酶的基因(SEQ ID NO.3的
第91
‑
951位核苷酸，1
‑
90位为信号肽序列)；PCR反应体系见表1，PCR反应程序为：预变性95℃10min；32个循环(变性95℃30s；退火55℃30s；延伸72℃1min；)延伸72℃10min；保存：4℃。将扩增后的PCR产物使用PCR纯化试剂盒进行纯化；将纯化后的产物与线性载体pET
‑
22b(+)(NdeI和XhoI双酶切)进行同源重组，50℃水浴反应5min；将5μL重组产物加入到100μL感受态细胞中，冰浴30min，然后42℃热激30s，冰浴反应2min，向离心管在加入500μL本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种角质酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.一种编码权利要求1所述的角质酶突变体的编码基因。3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。4.一种含有权利要求2所述的编码基因的重组载体。5.一种含有权利要求4所述的重组载体的重组工程菌。6.根据权利要求5所述的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌为大...

【专利技术属性】
技术研发人员：田新朋，石松标，李青连，杨键，刘玉，曾琦，殷建平，龙丽娟，
申请(专利权)人：中国科学院南海海洋研究所，
类型：发明
国别省市：