对硝基苄基酯酶突变体、编码基因及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种对硝基苄基酯酶突变体及编码基因，以及含对硝基苄基酯酶突变体的基因工程菌，及其在酶催化dl

【技术实现步骤摘要】
对硝基苄基酯酶突变体、编码基因及应用
(一)

[0001]本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种对硝基苄基酯酶突变体、编码基因，以及其在酶催化dl
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薄荷酯的手性拆分制备l
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薄荷醇中的应用。
(二)
技术介绍

[0002]l
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薄荷醇是常见的用于香精香料、化妆品和食品药品等领域的物质，具有兴奋、杀菌镇痛、止痒、芳香清凉等功能并且有的独特薄荷香气和清凉效果。l
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薄荷醇每年的市场需求大，全球l
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薄荷醇市场预计于2025年将达到14亿美金。
[0003]目前l
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薄荷醇行业领域的主要供应商有Agson Global、德之馨、南通薄荷厂、高砂香料、天银化工、Arora Aromatics、安徽丰乐香料、Swati Menthol&Allied Chem、NecLife、Bhagat Aromatics、KM Chemicals、Silverline Chemicals、安徽银丰药业、巨帮香料、翔升香料(淮安)有限公司和巴斯夫等企业。市面上的l
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薄荷醇主要分为天然l
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薄荷醇和合成l
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薄荷醇。随着生物技术的快速发展，其绿色环保且高效低成本的生产方式逐步吸引了人们视线，其中以生物酶法催化合成l
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薄荷醇的绿色合成技术也被不断探索与完善。生物酶催化效率高、选择性高、反应条件温和、能耗低、无毒害，符合绿色的发展方向，因此以高性能生物酶为基础的生物法制备工艺具有重要的应用价值。
[0004]现有一个来源枯草芽孢杆菌的对硝基苄基酯酶，在水解dl
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乙酸薄荷酯手性拆分制备l
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薄荷醇中具备反应速率快，底物投料量大等优点，但是其催化的立体选择性不高，且需要添加助溶剂如正丁醇等来提高酶的催化速率和催化的立体选择性。因此需要对该酯酶进行定向改造，提高其应用性能。
(三)
技术实现思路

[0005]本专利技术目的是提供一种催化性能优异的对硝基苄基酯酶突变体、编码基因，以及其在酶催化dl
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薄荷酯的手性拆分制备l
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薄荷醇中的应用。
[0006]本专利技术采用的技术方案是：
[0007]一种对硝基苄基酯酶突变体，由氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的对硝基苄基酯酶第109位、110位、193位、270位、273位、314位或362位中2个以上的氨基酸残基进行组合突变获得。
[0008]本专利技术通过在109位、110位、190位、193位、270位、273位、314位、358位、362位和362位的10个氨基酸残基位点，构建小而精的组合突变文库，即三密码子饱和突变技术，并结合多轮的迭代突变和筛选而获得的优异突变体。
[0009]本专利技术利用计算机辅助分析软件将野生型对硝基苄酯酶与底物乙酸l
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薄荷酯和乙酸d
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薄荷酯分别进行了对接分析，筛选出关键的氨基酸残基位点，结果如图2所示，即活性口袋周围的10个氨基酸残基。这些氨基酸残基与底物存在非键相互作用，同时影响着活性口袋的形状大小。通过组合突变并优化这些残基，可达优化酶与底物相互作用的空间位置和非键相互作用，使得酶对特定底物(如乙酸l
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薄荷酯)识别的选择性更强，从而提高酶
对底物的立体选择性。
[0010]将上述选择的10个氨基酸残基分成三组，即A组(Y109、L110、F134)、B组(A190、M193、M358)和C组(I270、L273、L362、F363)，并按照如图3所示的方案构建3个小而精的文库。其中每个位点采用3种氨基酸进行替换突变，包括缬氨酸、蛋氨酸和酪氨酸，即每个位点进行三个氨基酸密码子的饱和突变。通过混合的简并引物，应用PCR扩增方法引入随机组合的突变，从而扩增得到混合突变片段。再将混合片段与表达质粒进行接连，然后，利用热激法将重组的混合质粒转化进感受态细胞大肠杆菌BL21(DE3)中，构建了三密码子饱和突变的文库。从文库中挑取一定数量的单菌落，转接液体LB培养基并诱导蛋白表达，分别得到含不同突变酶的发酵细胞。最后，将含突变酶的细胞与底物进行反应，通过气相色谱分析底物的转化率和产物的对映体过量值(ee值)，比较分析各个菌落对应的酶活和底物立体选择性，从而筛选得到文库中的优异突变酶。通过比较最初构建的A、B、C三个文库的突变株，筛选最优突变体，进行下一轮的其他组别的迭代突变文库的构建和筛选，依次迭代后，筛选突变酶的数量达到了目标10个位点的三密码子饱和突变的>95％以上的覆盖率，从而实现了目标位点的组合优化，获得最优突变体。
[0011]优选的，所述的突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.3～6之一所示。所述的酯酶突变体包括四重突变体PNB
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Y109M/L110Y/M193Y/F314Y(简称为PNB
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MYYY)、五重突变体PNB
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Y109M/L110Y/M193Y/I270M/F314Y(简称PNB
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MYYMY)、五重突变体PNB
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Y109M/L110Y/M193Y/I270Y/F314Y(简称PNB
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MYYYY)、PNB
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Y109M/L110Y/M193Y/I270M/L273V/F314Y/L362V(七重突变体,简称PNB
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MYYMVYV)，对应的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。
[0012]SEQ ID NO.2所示为野生型对硝基苄基酯酶(PNB)的氨基酸序列，其来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.17904(CN 110373366 A)。该酶可对dl
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薄荷酯实现快速地手性拆分以制备l
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薄荷醇。其催化反应的优点是其水解速率快，底物dl
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薄荷酯投料量高等。但是，该酶催化过程中，需要有机助溶剂且酶催化的底物立体选择性偏低。本专利技术的技术方案是通过对野生型对硝基苄基酯酶PNB的底物结合口袋进行优化，即10个位点的组合突变优化改造，提高了酶的催化速率，同时显著提高其对底物的立体选择性，筛选得到的突变体水解dl
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薄荷酯生成的l
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薄荷醇的ee值>99％，表现出十分优异的立体选择性。
[0013]本专利技术还涉及编码所述对硝基苄基酯酶突变体的基因。
[0014]所述的酯酶突变体PNB
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MYYY、PNB
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MYYMY、PNB
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MYYYY、PNB
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MYYMVYV的编码基因，可以根据其氨基酸序列进行密码子优化后合成的基因序列，亦本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种对硝基苄基酯酶突变体，由氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的对硝基苄基酯酶第109位、110位、193位、270位、273位、314位或362位的氨基酸残基进行组合突变获得。2.如权利要求1所述的对硝基苄基酯酶突变体，其特征在所述的突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.3～6之一所示。3.编码权利要求1所述对硝基苄基酯酶突变体的基因。4.如权利要求3所述的编码基因，其特征在于所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.7～10之一所示。5.含有权利要求3所述编码基因的重组载体。6.含有权利要求3所述编码基因的基因工程菌。7.权利要求1所述对硝基苄基酯酶突变体在...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈小龙，桑玉敏，朱林江，陈翰驰，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：