本发明专利技术公开了一种产淀粉酶丝状真菌的高通量筛选方法及其应用，属于高通量筛选技术领域。本发明专利技术提供的方法可以同批分选出酿酒酵母、毕赤酵母和丝状真菌三种细胞群，而不仅仅局限于酿酒酵母；并且通过本方法得到的高淀粉酶酶活的菌株对微生物群落的影响较低，维持了酒体原有的风味。同时，本发明专利技术筛选到了一株紫红曲霉(Monascus purpureus)，该紫红曲霉可以使得酒醅中乙醇以外的醇类风味物质提高4.36倍，酯类的含量提高3.30倍；醛类含量提升3.83倍，有效降低会影响菌群平衡的乙酸的积累量，降低80％；新增风味物质任酮，提升酒体的花香、草药香，丰富酒体风味。丰富酒体风味。丰富酒体风味。
【技术实现步骤摘要】
一种产淀粉酶丝状真菌的高通量筛选方法及其应用
[0001]本专利技术涉及一种产淀粉酶丝状真菌的高通量筛选方法及其应用，属于高通量筛选
技术介绍
[0002]大曲是酿酒生产中重要的糖化剂和发酵剂，大曲中曲霉、根霉等丝状真菌是大曲生产中重要的产淀粉酶微生物
[1]，其产生的淀粉酶可将酿酒原料中的淀粉原料水解为单糖或多糖，为白酒酿造提供物质基础；另外丝状真菌的菌丝体对大曲曲块成型蓬松而不干裂和曲块颜色和风味有着重要的贡献，因此丝状真菌对大曲生产具有至关重要的作用
[2]，筛选性状优良的丝状真菌对生产强化大曲、改善大曲品质有着非常重要的意义。
[0003]目前传统分离丝状真菌的平板涂布法，耗时费力，效率低，且由于丝状真菌的菌丝发达，孢子容易扩散，使所获得的丝状真菌不易纯化；随着流式细胞术的不断进步和发展，流式细胞仪已被用于多种微生物的筛选
[3,4]，大大提高了微生物筛选的效率，目前所用流式细胞仪进行高通量筛选的多为纯种或者单一体系，固态发酵体系由于微生物与复杂物料充分混合，物料破碎度严重，易造成流式管道堵塞，因此应用流式细胞仪进行高通量筛选还比较困难；再者大曲体系微生物复杂，即使使用抗生素也只能将细菌和真菌区分开来，尚未有技术可以直接区分大曲这种复杂体系中酵母和丝状真菌，本研究通过富集前处理、探索合理的培养条件和时间，利用流式细胞仪对筛选对象的形态大小的区分，实现大曲中酵母和丝状真菌的直接区分，提高分选效率，结合适宜白酒酿造体系的固态培养基，能直接反应所筛选对象对酿酒体系淀粉酶活贡献情况。根据前期研究，酱香酒生产中，不正常的霉菌富集会导致酒醅中乙酸含量升高，进一步导致菌群紊乱的可能。跟据本方法所筛选出的霉菌应用于模拟发酵时能较好维持菌群的结构，避免过度富集导致乙酸升高，影响菌群的稳定性。
[0004][1]CHENB，wuQ，XUY.Filamentous fungal diversity and community structure associated with the solid
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state
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fermentation of Chinese Maotai flavor liquor
[0005][2]方程,杜海,徐岩.大曲丝状真菌的物种多样性及其次级代谢产物的合成潜力[J].食品与发酵工业,2019,45(15):1
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8.DOI:10.13995/j.cnki.11
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1802/ts.020601.
[0006][3]一种高通量筛选红曲色素高产菌株的方法
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CN109825495B
[0007][4]一种基于流式细胞术超高通量分离酿酒酵母单倍体的方法
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CN109355245A
技术实现思路
[0008]为了解决筛选适合大曲发酵且提高酒醅品质的霉菌，本专利技术提供了一种不同于外缘体系筛选菌株的高通量筛选方法，并筛选到了一株紫红曲霉(Monascus purpureus)。该紫红曲霉在提高酒醅中风味物质含量丰富酒醅中的风味物质种类，降低乙酸含量，降低对微生物群落的影响，从而维持酒体原有的风味。
[0009]本专利技术的第一个目的是提供一种高通量筛选丝状真菌的方法，所述方法的具体步骤如下：
[0010](1)将大曲样品加入无菌水中活化一段时间；
[0011](2)活化结束后经过滤膜取滤液离心；
[0012](3)收集离心后的沉淀，清洗后接种至改良富集培养基中进行富集；
[0013](4)富集完成后取一定菌液经过滤膜取滤液离心，收集菌体，再加入PBS缓冲液重悬清洗两次，最后收集的菌体再次用PBS重悬至适宜浓度；
[0014](5)所获得的菌液上机，调整流式细胞仪参数以区分不同细胞群；
[0015](6)将选定区域的细胞依次分选至装有改良富集培养基的的高通量孔板中；
[0016](7)将分选好的细胞置于孔板摇床进行培养；
[0017](8)将菌液转移至装有高粱固态培养基的深孔板中，进行固态培养；
[0018](9)提取固态发酵物粗酶液进行相应的酶活测定，挑选高酶活微生物进行菌种鉴定。
[0019]在一种实施方式中，步骤(1)中，所述大曲样品的种类为酱香型大曲，大曲样品和无菌水的质量体积比为1:2，活化时间为4～8h。
[0020]在一种实施方式中，步骤(2)和(4)中，，所述滤膜为50～75μm一次性细胞过滤器。
[0021]在一种实施方式中，步骤(3)和(6)中，所述改良富集培养基的组成为150～250g马铃薯，8～12g高粱支链淀粉，蒸馏水和酒醅浸提液制备的混合液1000mL，pH＝5.0；蒸馏水和酒醅浸提液的体积比为8：2。
[0022]在一种实施方式中，所述酒醅浸提液的制备方法为将酒醅和蒸馏水等比例混合，浸提至少30min，过滤，将滤液离心获得酒醅浸提液。
[0023]在一种实施方式中，步骤(3)中，所述培养温度28～32℃，摇床转速380～420rpm，培养时间5～7d。
[0024]在一种实施方式中，步骤(4)中，所述离心的条件为10000g，10min；所述适宜浓度为OD
600
＝0.2～0.5。
[0025]在一种实施方式中，步骤(5)中，所述流式细胞仪为BD FACSArica III，采用双通道，FSC通道参数设置为150～200，SSC通道参数设置为300～380，通道内细胞总量设置10000个。
[0026]在一种实施方式中，所述FSC通道参数设置为180，SSC通道参数设置为350。
[0027]在一种实施方式中，步骤(6)中，所述高通量孔板为96浅孔板。
[0028]在一种实施方式中，步骤(7)中，所述孔板摇床转述为400rpm，培养时间为3～5d。
[0029]在一种实施方式中，步骤(8)中，所述菌液的浓度OD
600
>1.0，培养温度28～32℃，培养时间为3～5d。
[0030]在一种实施方式中，步骤(9)中，所述粗酶液提取方法为：在每孔中加入4ml酶活测定缓冲溶液，浸泡30min后于孔板摇床中600rpm转30min；8000rpm离心10min后，取上清液进行测定。
[0031]在一种实施方式中，当测定的酶活为淀粉酶时，酶活测定缓冲液为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠缓冲液，pH6.0；当测定的酶活为糖化酶或纤维素酶，酶活测定缓冲液为乙酸
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乙酸钠缓冲液。
[0032]本专利技术的第二个目的是提供一株紫红曲霉Monascus purpureus，已于2022年08月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:62734，保藏地址为广州市
先烈中路100号大院59号楼5楼。
[0033]本专利技术的第三个目的是提供一种菌剂，所述菌剂含有上述紫红曲霉Monas本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种高通量筛选丝状真菌的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：(1)将大曲样品加入无菌水中活化一段时间；(2)活化结束后经过滤膜取滤液离心；(3)收集离心后的沉淀，清洗后接种至改良富集培养基中进行富集；(4)富集完成后取一定菌液经过滤膜取滤液离心，收集菌体，再加入PBS缓冲液重悬清洗两次，最后收集的菌体再次用PBS重悬至适宜浓度；(5)所获得的菌液上机，调整流式细胞仪参数以区分不同细胞群；(6)将选定区域的细胞依次分选至装有改良富集培养基的的高通量孔板中；(7)将分选好的细胞置于孔板摇床进行培养；(8)将菌液转移至装有高粱固态培养基的深孔板中，进行固态培养；(9)提取固态发酵物粗酶液进行相应的酶活测定，挑选高酶活微生物进行菌种鉴定。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述大曲样品的种类为酱香型大曲，大曲样品和无菌水的质量体积比为1:2，活化时间为4～8h。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)和(6)中，所述改良富集培养基的组成为150～250g马铃薯，8～12g高粱支链淀粉，蒸馏水和酒醅浸提液制备的混合液1000mL，pH＝5.0；蒸馏水和酒醅浸提液的体积比为8：2；所述酒醅浸提液的制备方法为将酒醅和蒸馏水等比例混合，浸提至少30min，过滤，将滤液离心获得...
【专利技术属性】
技术研发人员：王莉，艾梅，卢建军，黄婉秋，朱琪，曹青青，陈良强，杨帆，张娟，
申请(专利权)人：贵州茅台酒股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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