一种食源致病性气单胞菌的检测及分离方法技术

本发明专利技术公开了一种对食源致病性气单胞菌菌株的检测和分离方法：包括专用增菌液和显色培养基两部分，增菌液由特殊蛋白胨、胆盐和水组成；显色培养基由蛋白胨、糊精、麦芽糖、甜菜碱、胆盐、氯化钾、碳酸钾、硫酸镁、氨苄青霉素、头孢唑林、β

【技术实现步骤摘要】
一种食源致病性气单胞菌的检测及分离方法


[0001]本专利技术涉及一种致病性气单胞菌的检测及分离方法，尤其涉及一种食源致病性气单胞菌的识别和分离，属于食品安全微生物检验与监测领域。

技术介绍

[0002]气单胞菌属细菌是广泛分布于自然界水生环境中的腐物寄生菌，过去多认为气单胞菌对人类只是条件致病菌，但从20世纪80 年代以来，相继发现了多种致病性气单胞菌。病例报道和临床研究确认气单胞菌属中的一些菌种可致人类腹泻、急性胃肠炎、食物中毒、伤口感染、蜂窝组织炎以及免疫力低下患者的腹膜炎、败血症等医院内感染，且有多例气单胞菌急性感染致死亡的病例报道。气单胞菌已经成为一类新的人兽共患病的病原菌而倍受关注。
[0003]目前国内气单胞菌的研究主要为临床医院和水产养殖等机构，而对于食品中气单胞菌的研究相对较少。虽然已建立了较为系统的气单胞菌检验方法，但大多都是从病料或水样中直接培养分离出疑似菌株，然后再通过生化反应鉴定是否为气单胞菌属。气单胞菌尚未列入食品常规监测范围，相关的标准也仅限于嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌的检测。使用的分离培养基通常是添加了氨苄青霉素的麦康凯琼脂或以木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂（Xylose Lysine Desoxycholate Medium,XLD）为基础修改而成的。麦康凯琼脂和XLD培养基是利用细菌发酵培养基中糖类产酸的原理，结合酸碱指示剂分离出疑似菌株，通常用于分离肠杆菌科细菌，并不是针对气单胞菌属的选择分离培养基。国家标准GBT18652
‑
2002规定了致病性嗜水气单胞菌的检验方法，使用RS培养基对污染病料进行病原分离，疑似嗜水气单胞菌进行生化指标测定，若氧化酶阳性、AHM鉴别特征（顶部仍为紫色，底部为淡黄色；细菌沿穿刺线呈刷状生长，即运动力阳性；部分菌株顶部呈黑色）、吲哚阳性、革兰氏阴性、糖发酵阳性即判定为嗜水气单胞菌。上述方法操作繁琐且效率较低，目前没有食源致病性气单胞菌的专用检测分离方法。
[0004]显色培养基法以传统培养基为基础，通过添加特异性酶底物的细菌生化鉴定技术，把培养、分离、鉴别一次完成，操作简便，大幅度缩短了检测时间，并通过目标菌特征性识别提高了准确性，因此具有广阔应用前景，已应用于临床医学、食品卫生、环境保护等多个领域中沙门氏菌、弧菌、李斯特氏菌、致病性大肠杆菌O157等细菌检测。目前没有针对气单胞菌的显色培养基，因此，本领域需要一种高效、快速、低廉、操作简便的方法，进行气单胞菌的分离与检测。

技术实现思路

[0005]本专利技术运用生物化学，微生物学及无机、有机和分析化学的原理，对不同的碳源、氮源、无机盐类、维生素、pH 值等因素进行筛选优化，提供一种选择性高、检测周期短、成本低、可操作性强，适用于食品检测样本中致病气单胞菌的检测及分离方法。
[0006]本专利技术所采取的技术方案为：一种致病性气单胞菌的检测及分离方法，反应体系
包含专用增菌液和显色培养基；其中，每1000mL的增菌液包括：蛋白胨10~20g、胆盐2~5g，余量为水，pH为8.5
±
0.2；每1000mL的显色培养基包括：蛋白胨10~20g、糊精5~12g、甜菜碱0~2g、胆盐3~5g、硫代硫酸钠0~5g、柠檬酸铁铵0~1g、氯化钾3~5g、碳酸钾1~2g、硫酸镁0~0.5g、琼脂15~18g、PEG 0~2g、泊洛沙姆0~2g、6
‑
氯
‑3‑
吲哚
‑
β
‑
D
‑
半乳糖苷0.1~0.2g、溴百里酚蓝0~0.1g、百里酚蓝0~0.1g、氨苄青霉素2~8mg、头孢唑林2~8mg，余量为水，pH为7.6
±
0.2。
[0007]在一些实施例中，增菌液所述蛋白胨为不含氯化钠的酪蛋白胨。
[0008]在一些实施例中，显色培养基所述蛋白胨为鱼蛋白胨和胰蛋白
䏡
。
[0009]在一些实施例中，优选为，所述胆盐为脱氧胆酸钾、猪胆钾盐或牛胆钾盐。
[0010]在一些实施例中，优选为，所述PEG为PEG4000。
[0011]在一些实施例中，增菌液优选为，每1000mL的培养基包括：不含氯化钠的酪蛋白胨10g、猪胆钾盐2g，余量为水，pH为8.5
±
0.2。
[0012]在一些实施例中，显色培养基优选为，每1000mL的培养基包括：鱼蛋白胨6g、胰蛋白
䏡
3g、糊精12g、甜菜碱1g、牛胆钾盐3g、氯化钾5g、碳酸钾1.5g、硫酸镁0.1g、琼脂15g、PEG4000 1g、6
‑
氯
‑3‑
吲哚
‑
β
‑
D
‑
半乳糖苷0.1g、溴百里酚蓝0.08g、氨苄青霉素5mg、头孢唑林5mg，余量为水，pH为7.6
±
0.2。
[0013]在一些实施例中，显色培养基优选为，每1000mL的培养基包括：鱼蛋白胨5g、胰蛋白
䏡
5g、糊精10g、麦芽糖2g、猪胆钾盐3g、碳酸钾1.2g、硫酸镁0.1g、琼脂15g、泊洛沙姆1g、6
‑
氯
‑3‑
吲哚
‑
β
‑
D
‑
半乳糖苷0.1g、溴百里酚蓝0.04g、百里酚蓝0.04g、氨苄青霉素5mg、头孢唑林5mg，余量为水，pH为7.6
±
0.2。
[0014]本专利技术使用不含氯化钠的酪蛋白胨和钾胆盐配置成碱性0% NaCl增菌液，可抑制样品中所有的革兰氏阳性细菌和大部分革兰氏阴性菌的生长，但气单胞菌属生长不受影响。《伯杰氏细菌系统分类学手册》中明确指出，气单胞菌可分为嗜温群与嗜冷群，嗜温群气单胞菌多为人类致病病原菌，最佳生长温度范围为22℃~37℃，嗜冷群气单胞菌多为水生动物致病病原菌，最适生长温度为22℃~25℃。因此在36℃
±
1℃培养时，致病性气单胞菌可快速繁殖，而嗜冷群气单胞菌被抑制。
[0015]本专利技术在显色培养基中使用鱼蛋白胨和胰蛋白
䏡
为主要营养成分，其独特的碳氮比及蛋白分子结构可诱导气单胞菌在短时间内大量产酶。
[0016]本专利技术在显色培养基中添加了抗生素，抗生素能抑制某些菌生长，优选的氨苄青霉素和头孢唑林均为广谱抗生素，可抑制大部分细菌生长。而致病性气单胞菌含有金属酶CphA，可产生诱导型β
‑
内酰胺酶，对碳青霉烯类抗生素耐药。
[0017]本专利技术在显色培养基中添加了β
‑
半乳糖苷显色底物6
‑
氯
‑3‑
吲哚
‑
β
‑
D
‑
吡喃半乳糖苷，能表达产生β
‑
半乳糖苷酶的细菌在酶的作用下分解显色底物，形成粉红色菌落。致病性气单胞菌无β
‑
半乳糖苷酶，但在此培养基的碳氮比条件下，可本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种食源致病性气单胞菌的检测及分离方法，其特征在于，所述的反应体系包含专用增菌液和显色培养基；其中，所述增菌液包括：蛋白胨10~20g/L、胆盐2~5g/L，余量为水，pH为7.2
±
0.2；所述显色培养基包括：蛋白胨10~20g/L、糊精5~12g/L，麦芽糖0~2g/L、甜菜碱0~2g/L、胆盐3~5g/L、氯化钾3~5g/L、碳酸钾1~2g/L、硫酸镁0~0.5 g/L、氨苄青霉素5~10mg/L、头孢唑林5~10mg/L、显色剂及底物分散剂含量为2~5g/L，琼脂含量为15~18g/L，余量为水，pH为7.6
±
0.2。2.如权利要求1所述用于分离和检测食源致病性气单胞菌的专用增菌液，其特征在于，所述蛋白胨为不含氯化钠的酪蛋白胨；所述胆盐为钾胆盐，脱氧胆酸钾、猪胆盐、牛胆盐单一或组合成分。3.如权利要求1所述用于分离和检测食源致病性气单胞菌的显色培养基，其特征在于，所述蛋白胨为鱼蛋白胨、胰蛋白
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【专利技术属性】
技术研发人员：陈颖，姬庆龙，赵贵明，赵勇胜，王娉，赵晓美，杨海荣，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：