一种MK-7高产菌的筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种MK

【技术实现步骤摘要】
一种MK
‑
7高产菌的筛选方法


[0001]本专利技术涉及一种MK
‑
7高产菌的筛选方法，属于微生物育种


技术介绍

[0002]维生素K在自然界中主要以两种形式存在，即维生素K1和维生素K2。维生素K1，又称叶绿醌，主要存在于植物中。维生素K2，也被称为甲萘醌(MK)，多存在于细菌中。维生素K2是由一个甲基化的萘醌环和位于其C3位上的可变异戊二烯侧链组成，并且根据异戊二烯单元的数量来区分各亚型。而其中的MK
‑
7拥有七个异戊二烯单元，并且由于其高生物活性和对预防一些疾病如骨质疏松症和心脑血管疾病等方面的重要性，因此也是研究者们最为关注的一种亚型。
[0003]MK
‑
7目前主要通过化学合成法和微生物发酵法进行生产。而相比于化学合成法，微生物发酵法具有反应条件温和，无污染和安全可靠等优点。目前在微生物发酵生产中，主要通过芽孢杆菌类进行MK
‑
7的合成，如纳豆芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。由于野生型菌株的MK
‑
7产量较低，因此研究者们采用多种手段如传统随机诱变或者基因工程技术对菌株进行改造，使其MK
‑
7产量有所提升。然而解淀粉芽孢杆菌或者纳豆芽孢杆菌等基因编辑技术开发尚未成熟时，大多只能通过随机诱变或原生质体融合等传统育种技术进行MK
‑
7高产菌株选育。而ARTP诱变技术相比较其它传统的化学或物理诱变方式，具有无毒害，操作简单和正突变率高等优势，在微生物育种方面的应用日益增多；而原生质体融合技术能够将多个母本菌株的优势集中到同一株重组菌体中。但是目前还没有方法将ARTP诱变技术与原生质体融合技术结合在一起用于筛选MK
‑
7高产菌的报道，尤其是在筛选过程中存在操作繁琐、工作量大的问题。

技术实现思路

[0004]为解决上述问题，本专利技术通过组合使用ARTP诱变和原生质体融合技术，结合六种结构类似物抗性特征进行菌株筛选。经过两轮育种最终得到一株同时具有磺胺胍、1
‑
羟基
‑2‑
萘甲酸、甲萘醌、2
‑
脱氧
‑
D
‑
葡萄糖、利福平抗性和β
‑
氟丙酮酸敏感型的菌株，并且该菌的MK
‑
7产量得到大幅提升。该菌在摇瓶发酵6d后的MK
‑
7产量达到了73.57
±
1.61mg/L，相比出发菌株H.β.D.R.
‑
5提升了1.36倍。
[0005]本专利技术的目的在于提供一种MK
‑
7高产菌的筛选方法，对原始菌株进行ARTP诱变和原生质体融合，并采用磺胺胍抗性、1
‑
羟基
‑2‑
萘甲酸抗性、甲萘醌抗性、2
‑
脱氧
‑
D
‑
葡萄糖抗性、利福平抗性和β
‑
氟丙酮酸敏感型遗传特征进行选育，得到MK
‑
7高产菌株。
[0006]进一步地，所述方法包括如下步骤：
[0007]S1、将原始菌株培养至对数期后，采用ARTP诱变，诱变后采用结构类似物抗性平板进行初筛，再使用摇瓶发酵进行复筛，分别筛选得到一株具有磺胺胍抗性的MK
‑
7产量较高的菌株、一株具有1
‑
羟基
‑2‑
萘甲酸抗性的MK
‑
7产量较高的菌株和一株具有甲萘醌抗性的MK
‑
7产量较高的菌株；
[0008]S2、将S1步骤筛选得到的三株菌株进行原生质体融合，并筛选得到一株同时具有磺胺胍抗性、1
‑
羟基
‑2‑
萘甲酸抗性和甲萘醌抗性的MK
‑
7产量较高的菌株；
[0009]S3、将S2步骤筛选得到的菌株培养至对数期后，采用ARTP诱变，诱变后采用结构类似物抗性平板进行初筛，再使用摇瓶发酵进行复筛，分别筛选得到一株具有2
‑
脱氧
‑
D
‑
葡萄糖抗性的MK
‑
7产量较高的菌株、一株具有利福平抗性的MK
‑
7产量较高的菌株和一株具有β
‑
氟丙酮酸敏感型的MK
‑
7产量较高的菌株；
[0010]S4、将S3步骤中筛选得到的三株菌株进行原生质体融合，并筛选得到一株同时具有磺胺胍抗性、1
‑
羟基
‑2‑
萘甲酸抗性、甲萘醌抗性、2
‑
脱氧
‑
D
‑
葡萄糖抗性、利福平抗性和β
‑
氟丙酮酸敏感型遗传特征的MK
‑
7高产菌株。
[0011]进一步地，所述原始菌株为解淀粉芽孢杆菌。
[0012]进一步地，ARTP诱变包括如下步骤：
[0013]在诱变前，将待诱变菌株培养至对数期，离心收集菌体，并采用无菌生理盐水洗涤2
‑
3次，制备成菌悬液；将菌悬液涂布在载片上进行ARTP诱变；诱变后将载片放入无菌生理盐水中震荡处理得到菌悬液，将菌悬液涂布至在含有结构类似物的LB平板上培养36～48h。
[0014]进一步地，所述无菌生理盐水中含有4％～6％甘油。
[0015]进一步地，原生质体融合包括如下步骤：
[0016]将待融合的菌株分别在LB培养基中培养到对数期，离心获得细胞，并采用SMM溶液洗涤2～3次，洗涤后将细胞在含有0.1～0.2mg/mL溶菌酶的SMM缓冲液中调整到10
7～8
个细胞/每毫升，在36～38℃孵育10～30min得到原生质体；将原生质体离心洗涤后，将待融合的菌株的原生质体进行混合并洗涤，洗涤后重悬于0.1～0.3mL SMM缓冲液中，并加入1.6～2.0mL 35～45％PEG 6000溶液，在36～38℃下处理8～12min获得融合的原生质体；将融合的原生质体洗涤并加入SMM缓冲液重悬，重悬后涂布至RM平板上培养，培养后采用SMM缓冲液将RM平板上的再生菌落进行重悬，然后涂布至同时含有各亲本菌株所带有的结构类似物抗性的LB平板上，筛选得到融合菌株。
[0017]进一步地，所述摇瓶发酵进行复筛包括如下步骤：
[0018]首先将菌株接种至LB培养基中，36～38℃过夜震荡培养；震荡培养后接种于种子培养基中震荡培养至对数后期得到种子培养液；将种子培养液接种至发酵培养基中震荡培养5～7d。
[0019]进一步地，所述的LB培养基为：胰蛋白胨8～12g/L，酵母提取物4～6g/L，NaCl 8～12g/L；种子培养基为：大豆蛋白胨14～16g/L，葡萄糖14～16g/L，KH2PO40.8～1.2g/L，K2HPO4·
3H2O 2.4～2.6g/L，MgSO4·
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种MK
‑
7高产菌的筛选方法，其特征在于，对原始菌株进行ARTP诱变和原生质体融合，并采用磺胺胍抗性、1
‑
羟基
‑2‑
萘甲酸抗性、甲萘醌抗性、2
‑
脱氧
‑
D
‑
葡萄糖抗性、利福平抗性和β
‑
氟丙酮酸敏感型遗传特征进行选育，得到MK
‑
7高产菌株。2.根据权利要求1所述筛选方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1、将原始菌株培养至对数期后，采用ARTP诱变，诱变后采用结构类似物抗性平板进行初筛，再使用摇瓶发酵进行复筛，分别筛选得到一株具有磺胺胍抗性的MK
‑
7产量较高的菌株、一株具有1
‑
羟基
‑2‑
萘甲酸抗性的MK
‑
7产量较高的菌株和一株具有甲萘醌抗性的MK
‑
7产量较高的菌株；S2、将S1步骤筛选得到的三株菌株进行原生质体融合，并筛选得到一株同时具有磺胺胍抗性、1
‑
羟基
‑2‑
萘甲酸抗性和甲萘醌抗性的MK
‑
7产量较高的菌株；S3、将S2步骤筛选得到的菌株培养至对数期后，采用ARTP诱变，诱变后采用结构类似物抗性平板进行初筛，再使用摇瓶发酵进行复筛，分别筛选得到一株具有2
‑
脱氧
‑
D
‑
葡萄糖抗性的MK
‑
7产量较高的菌株、一株具有利福平抗性的MK
‑
7产量较高的菌株和一株具有β
‑
氟丙酮酸敏感型的MK
‑
7产量较高的菌株；S4、将S3步骤中筛选得到的三株菌株进行原生质体融合，并筛选得到一株同时具有磺胺胍抗性、1
‑
羟基
‑2‑
萘甲酸抗性、甲萘醌抗性、2
‑
脱氧
‑
D
‑
葡萄糖抗性、利福平抗性和β
‑
氟丙酮酸敏感型遗传特征的MK
‑
7高产菌株。3.根据权利要求2所述筛选方法，其特征在于，所述原始菌株为解淀粉芽孢杆菌。4.根据权利要求2所述筛选方法，其特征在于，ARTP诱变包括如下步骤：在诱变前，将待诱变菌株培养至对数期，离心收集菌体，并采用无菌生理盐水洗涤2
‑
3次，制备成菌悬液；将菌悬液涂布在载片上进行ARTP诱变；诱变后将载片放入无菌生理盐水中震荡处理得到菌悬液，将菌悬液涂布至在含有结构类似物的LB平板上培养36～48h。5.根据权利要求4所述筛选方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐建中，李昌隆，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：