一种弓形虫闭管可视化检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术提供一种弓形虫闭管可视化检测试剂盒及其检测方法。该弓形虫检测试剂盒包含如下组分：市售PCR管、SPA恒温扩增体系、以及H

【技术实现步骤摘要】
一种弓形虫闭管可视化检测试剂盒及其检测方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，特别涉及一种弓形虫闭管可视化检测 试剂盒及其检测方法。

技术介绍

[0002]弓形虫是一种在世界范围内广泛分布的寄生虫，可感染大多数温血动物。 此外，它还可以通过食物和受污染的水传播。目前，世界上超过30％的人口 被认为是弓形虫的慢性感染。因此，弓形虫病被联合国粮食及农业组织(FAO) 和世界卫生组织(WHO)列为全球关注的食源性寄生虫感染。近年来，随着分 子生物学的迅猛发展，鉴定弓形虫的方法扩展到新型的分子生物学方法。最为 常见的分子生物学方法中以PCR和LAMP扩增为主，针对弓形虫的特异性基因 组进行引物设计，实现弓形虫的快速检测。随着人们的生活水平的不断提高， 畜牧业的需求和宠物的拥有率也越来越高，因此针对寄生虫的快速检测也提 出了更高的要求，即能够实现现场、快速、高灵敏、强特异、低成本等特点。
[0003]其中LAMP扩增是一种成熟的等温扩增技术，该技术利用内引物、外引物 与聚合酶结合，在恒温条件下进行等温扩增反应。但是该方法的体系复杂、引 物设计难度高，且容易出现假阳性现象。目前，随着核酸扩增的理论不断深入， 越来越多的LAMP扩增改良变体被提出。在这些方法中，基于一对普通引物和 发夹引物的茎环引物辅助等温扩增(SPA)无疑具有巨大的潜力。该方法可以 提高响应速度和抗干扰能力，同时确保设计的简单性。但是该方法缺乏实际场 景下的应用和检验。
[0004]随着等温扩增的广泛应用，信号输出方法不断丰富。在条件允许的情况下， 以电化学和表面等离子共振方法为代表的复杂传感器是获得高灵敏度的最佳 选择。定制设备，如微流体、微阵列和多通道纸基设备是高通量检测的理想选 择。然而，它们的高成本和工艺要求往往限制了这些方法在实验室中的应用。 由于等温扩增的高灵敏度，传统的荧光和比色法早已能够满足各种检测要求。 与荧光传感器相比，基于镁离子(Mg
2+
)和氢离子(H
+
)指示剂的比色传感器 由于其肉眼结果可视化的优势，越来越多地用于实验室和商业环境中。然而， 目前，比色法仅限于Mg
2+
指示剂，如羟基萘酚蓝(HNB)和酸性铬蓝K (ACBK)以及中性红(NR)、酚红(PR)、甲酚红(CR)、品红和二甲酚橙(XO) 等H
+
指示剂。虽然最近一些新的指标被应用于等温放大的信号输出，但它们 的颜色变化不明显或需要在反应后添加。
[0005]基于此，本申请提供一种弓形虫闭管快速可视化检测试剂盒及其检测方 法。闭管比色检测实现了弓形虫的快速防污染检测，即通过一步法闭管反应实 现；优化SPA扩增体系，降低SPA非特异性扩增实现；可视化通过比色指示剂 溴百里酚蓝(BTB)实现。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术提供了一种弓形虫闭管快速可视化检测试剂盒及其检 测方法。本专利技术将SPA恒温扩增和pH指示剂BTB结合起来，并联用智能手机的 RGB分析技术，实现了对弓形虫的闭管检测，具有快速、特异性强、高灵敏、 抗干扰强、可视化、操作便捷等特点。
[0007]本专利技术的目的是提供用于检测弓形虫特异基因(AF146527.1的328
‑
372) 为靶基因的SPA闭管可视化快速检测方法。
[0008]本专利技术采用的技术方案是：将SPA扩增体系与BTB比色指示剂结合起来 检测弓形虫特异基因。
[0009]本专利技术的适用范围：各领域弓形虫的快速检测。
[0010]本专利技术的操作方法：按要求的体系和程序结束反应后，裸眼观察结果即可， 或结合智能手机进行RGB辅助分析。
[0011]本专利技术的结果判定：待反应结束后，裸眼观察溶液的颜色变化。溶液呈蓝 色，说明无弓形虫；溶液呈黄色，说明含有大量弓形虫；溶液呈黄绿色，说明 含有少量弓形虫。
[0012]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0013]一方面本专利技术提供一种弓形虫闭管可视化检测方法，以弓形虫基因片段 为靶标设计SPA引物，进行SPA恒温扩增，结合H
+
响应相关试剂实现闭管 可视化检测；
[0014]所述SPA引物为包括：
[0015]Toxo
‑
HF引物：序列如SEQ ID NO：1；
[0016]Toxo
‑
HR引物：序列如SEQ ID NO：2；
[0017]Toxo
‑
F引物：序列如SEQ ID NO：3；
[0018]Toxo
‑
R引物：序列如SEQ ID NO：4；
[0019]所述SPA恒温扩增体系如下：
[0020][0021]优选的，SPA恒温扩增体系为：
[0022][0023]所述H
+
响应相关试剂为0.1％BTB溶液；
[0024]所述检测方法的评判标准有两种方法：
[0025]Ⅰ.肉眼直接观察：SPA恒温扩增会引起反应体系的pH变化，根据BTB 的颜色变化程度确定靶基因浓度；
[0026]Ⅱ.结合智能手机分析：BTB显色结果拍照，然后根据手机软件进行RGB 分析，确定靶基因浓度；
[0027]所述扩增的反应程序为58
‑
70℃85
‑
100min，80℃10min；
[0028]优选的，扩增的反应程序为67℃下反应85min。
[0029]另一方面，本专利技术提供了一种弓形虫检测试剂盒，包括如下组分：市售 PCR管、SPA扩增体系以及H
+
响应相关试剂；
[0030]所述市售PCR管为开盖式设计；
[0031]所述SPA恒温扩增体系包括SPA扩增引物、dNTPs、甜菜碱、MgSO4、 缓冲液、Bst DNA聚合酶、SYTO
‑
9染料及水；
[0032]其中SPA扩增引物包括：
[0033]Toxo
‑
HF引物：序列如SEQ ID NO：1；
[0034]Toxo
‑
HR引物：序列如SEQ ID NO：2；
[0035]Toxo
‑
F引物：序列如SEQ ID NO：3；
[0036]Toxo
‑
R引物：序列如SEQ ID NO：4。
[0037]所述H
+
响应相关试剂为0.1％的BTB溶液。
[0038]具体的，SPA恒温扩增体系包括：
[0039][0040][0041]所述扩增的反应程序为58
‑
70℃ 85
‑
100min，80℃ 10min；
[0042]优选的，扩增的反应程序为67℃下反应85min。
[0043]当反应结束后，通过溶液的是否从蓝色转为黄色判定基因组的有无。
[0044]本专利技术以弓形虫为研究对象，利用SP本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种弓形虫闭管可视化检测方法，其特征在于，以弓形虫基因片段为靶标设计SPA引物，进行SPA恒温扩增，结合H
+
响应相关试剂实现闭管可视化检测；所述弓形虫基因片段为GEN BAKN：AF146527.1的328
‑
372；所述SPA引物为包括：Toxo
‑
HF引物：序列如SEQ ID NO：1；Toxo
‑
HR引物：序列如SEQ ID NO：2；Toxo
‑
F引物：序列如SEQ ID NO：3；Toxo
‑
R引物：序列如SEQ ID NO：4；所述SPA恒温扩增体系如下：所述H
+
响应相关试剂为0.1％BTB溶液；所述检测方法的评判标准有两种方法：Ⅰ.肉眼直接观察：SPA恒温扩增会引起反应体系的pH变化，根据BTB的颜色变化程度初步确定靶基因浓度；Ⅱ.结合智能手机分析：BTB显色结果拍照，然后根据手机软件进行RGB分析，大致确定靶基因浓度。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述扩增的反应程序为58
‑
70℃ 85
‑
100min，80℃ 10min。3.一种弓形虫闭管可视化检测试剂盒，其特征在于，包含市售PCR管、SPA恒温扩增体系以及H
+
响应相关试剂；所述市售PCR管为开盖式设计；所述SPA恒温扩增体系包括SPA扩增引物、dNTPs、甜菜碱、MgSO4、缓冲液、Bst DNA聚合酶、SYTO

【专利技术属性】
技术研发人员：许文涛，张素英，林晟豪，朱龙佼，杜再慧，
申请(专利权)人：山东第一医科大学山东省医学科学院，
类型：发明
国别省市：