基于ERA技术的对虾肝肠胞虫快速检测方法及引物与探针组合技术

本发明专利技术提出了基于ERA技术的对虾肝肠胞虫快速检测方法及引物与探针组合，包括一对ERA特异性引物和一条特异性荧光探针，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。本发明专利技术建立的ERA技术的对虾肝肠胞虫快速检测方法，可以明显缩短对虾肝肠胞虫的检测时间；同时操作简单，灵敏度高、特异性强，可满足快速检测的需求，且检测成本低。且检测成本低。

【技术实现步骤摘要】
基于ERA技术的对虾肝肠胞虫快速检测方法及引物与探针组合


[0001]本专利技术涉及病原体检测
，特别涉及基于ERA技术的对虾肝肠胞虫快速检测方法及引物与探针组合。

技术介绍

[0002]肝肠胞虫(Enterocytozoon hpatopenaei,EHP)又称肠胞虫，隶属于真菌界(Fungi)、微孢子门(Microsporidia)，肠胞虫属(Enterocytozoon)，是一种胞内寄生虫，主要寄生于对虾的肝胰腺上皮细胞，具有高度传染性。EHP最早于2003年在泰国斑节对虾(Penaeus monodon)中发现，随后国内外对其开展大量相关研究。近年来，EHP引起对虾生长缓慢的现象在东南亚频繁报道。从2013年开始，我国多个省市的虾类养殖基地先后发现了EHP感染，并且感染率呈上涨趋势。被感染的对虾虽不影响饲养和存活率，但对虾通常表现为生长缓慢，个体大小不均，免疫力低下，易被其他病原体感染，已成为我国对虾养殖的重要病原之一。由于目前尚无治疗EHP的有效方法，只能通过即时检测和综合防控，才能避免病原体的流行与扩散。
[0003]EHP个体微小，被感染的对虾症状不明显，因此，很难在现场确诊。传统的组织切片方法制作时间长，流程复杂，在肝肠胞虫含量低的条件下不易发现，不适合作为判断是否感染发病的技术手段。现有免疫学检测方法，虽可以检测不同种类的微孢子虫，但是灵敏度不高，易出现假阳性，抗体筛查过程缓慢，且价格昂贵。而分子生物学方法具有快速、简便和灵敏度高等特点，已成为实验室检测EHP的常规手段。目前常用的检测方法有普通PCR、巢式PCR、qRT
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PCR、原位杂交、环介导等温扩增技术(LAMP)等方法。这些方法普遍存在耗时长，操作复杂，成本高昂的特点。其中LAMP技术可在恒温条件进行，但引物体系复杂，易产生假阳性。这些特点限制了上述方法的现场检测使用。因此，需开发一种快速简便的检测方法，对EHP的预防具有重要意义。本专利技术建立了ERA恒温荧光检测EHP的方法，快速方便，准确可靠，满足养殖场现场检测需求。
[0004]酶促重组等温扩增(Enzymatic Recombinase Amplification，ERA)是一种恒温扩增技术，反应体系中的重组酶与引物结合形成蛋白
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DNA复合物,与核酸模板上的同源序列结合，同时在单链DNA结合蛋白(SSB)协助下,DNA聚合酶引导产生解链和DNA合成,最终形成新的DNA双链,从而实现高效扩增。与其他恒温扩增技术相比，ERA可在25～45℃条件下进行扩增反应，不需要热变性，对硬件设备要求低，并且核酸扩增速度较快，可在20min内获得目的扩增产物，能够在现场检测快速出具报告，极大缩短了检测时间。

技术实现思路

[0005]本专利技术为解决现有技术中出现的问题，提供了一种对虾肝肠胞虫ERA恒温荧光检测方法及引物与探针组合，可以明显缩短对虾肝肠胞虫的检测时间；同时操作简单，灵敏度高、特异性强，满足快速检测的需求，为对虾养殖中肝肠胞虫的监测提供了一种有效手段。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
[0007]本专利技术目的之一是，提供基于ERA技术的对虾肝肠胞虫的引物与探针组合，包括一对ERA特异性引物和一条特异性荧光探针：
[0008]正向引物：5'TTGCAGAGTGTTGTTAAGGGTTTAAGTA3'(SEQ ID NO.1)
[0009]反向引物：5'CTTCTTTAAGCTGTTTGTCTCCAACTGTATT 3'(SEQ ID NO.2)
[0010]探针：5'AGAGACGATATTTACACAGACACAGCATTT 3'(SEQ ID NO.3)(THF)5'TAGGATATGAGCTTTC 3'(SEQ ID NO.4)(C3
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SPACER)
[0011]优选地，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的所述探针的3'端标记荧光报告基团，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的所述探针的5'端标记荧光淬灭基团；在所述荧光报告基团和荧光淬灭基团之间插入一个四氢呋喃。
[0012]优选地，所述荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ1；在ERA体系中引入带荧光标记的探针，配合相应扩增引物，可以有效提高ERA检测的特异性。
[0013]优选地，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的所述探针，自5'端起第30位碱基T标记荧光报告基团(6FAM
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dT)，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的所述探针，自5'端起第1位碱基T标记荧光淬灭基团(BHQ1
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dT)；核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的所述探针，3'端还标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团(C3
‑
SPACER)。
[0014]本专利技术目的之二是，提供上述的引物与探针组合用于ERA技术的对虾肝肠胞虫的快速检测方法，包括如下步骤：
[0015]1)提取待测样本对虾的DNA；
[0016]2)以该DNA为模板，采用上述引物对和荧光探针进行ERA扩增，用荧光检测装置检测扩增体系中荧光信号的变化，判断待测样本对虾是否感染肝肠胞虫。
[0017]优选地，所述样本为成虾，则提取肝胰腺组织，所述样本为虾苗，则提取甲壳下组织。
[0018]优选地，所述ERA扩增的温度为36～42℃；推荐温度为42℃。
[0019]优选地，所述ERA扩增的反应时间为20min，共40个循环。
[0020]优选地，所述ERA扩增的反应体系包括所述引物对、所述探针、溶解剂、DNA模板和激活剂；所述引物的加量为2.0～3.0μL，探针加量为0.6
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1.0μL。
[0021]优选地，ERA扩增结果判定方法如下：
[0022]ERA荧光扩增曲线呈“S”型且CT值≤35，判断为对虾肝肠胞虫阳性结果；
[0023]ERA荧光扩增曲线不呈“S”型或CT值＞35，判断为对虾肝肠胞虫阴性结果。
[0024]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0025](1)操作简便。本专利技术涉及的检测方法可摆脱对大型仪器及专业检测实验室的依赖，在36～42℃下完成检测，无需专业操作人员，可在户外进行，有实际的使用需求。
[0026](2)高效快速。本专利技术涉及的检测方法整个过程可在半小时内完成，提高对虾肝肠胞虫检测的效率。
[0027](3)高特异及灵敏性。本专利技术涉及的检测方法对对虾常见病原基因组DNA，包括急性肝胰腺坏死病(Acute hepatopancreatic necrosis disease,AHPND)病原菌、传染性表皮与造血组织坏死症病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)、白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)，均不发生非特本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于ERA技术的对虾肝肠胞虫的引物与探针组合，其特征在于，包括一对ERA特异性引物和一条特异性荧光探针，所述引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示。2.根据权利要求1的基于ERA技术的对虾肝肠胞虫的引物与探针组合，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的所述探针的3'端标记荧光报告基团，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的所述探针的5'端标记荧光淬灭基团；在所述荧光报告基团和荧光淬灭基团之间插入一个四氢呋喃。3.根据权利要求2的基于ERA技术的对虾肝肠胞虫的引物与探针组合，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ1。4.根据权利要求2的基于ERA技术的对虾肝肠胞虫的引物与探针组合，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的所述探针，自5'端起第30位碱基T标记荧光报告基团，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的所述探针，自5'端起第1位碱基T标记荧光淬灭基团；核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的所述探针，3'端还标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。5.根据权利要求1～4任意一项所述的引物与探针组合用于ERA技术的对虾肝肠胞虫的快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：王孟强，李姣冰，胡景杰，包振民，王燕，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：