同时检测猪内阿米巴原虫和波氏内阿米巴原虫的双重PCR的引物及方法和应用技术

本发明专利技术属于分子检测技术领域，具体为同时检测猪内阿米巴原虫和波氏内阿米巴原虫的双重PCR的引物及方法和应用，包括以下引物：猪内阿米巴原虫种特异性引物的上游引物E.suis F和下游引物E.suis R、波氏内阿米巴原虫种特异性引物的上游引物E.poleckiF和下游引物E.polecki R；E.suis F、E.suisR、E.poleckiF、E.polecki R的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示，本发明专利技术能同时检测猪内阿米巴原虫和波氏内阿米巴原虫，最低能检查到400fg/μL的阳性DNA。最低能检查到400fg/μL的阳性DNA。最低能检查到400fg/μL的阳性DNA。

【技术实现步骤摘要】
同时检测猪内阿米巴原虫和波氏内阿米巴原虫的双重PCR的引物及方法和应用


[0001]本专利技术涉及分子检测
，具体涉及同时检测猪内阿米巴原虫和波氏内阿米巴原虫的双重PCR的引物及方法和应用。

技术介绍

[0002]阿米巴原虫是可寄生于人和动物肠道及其他内脏器官的人兽共患原虫，种类较多，根据其生活环境不同分为内阿米巴和自由生活阿米巴，前者寄生于人和动物，主要有4个属，即内阿米巴属(Entamoeba)、内蜒属(Endolimax)、嗜碘阿米巴属(Iodamoeba)和脆双核阿米巴属(Dientamoeba)。其中内阿米巴属中的溶组织内阿米巴原虫(Entamoeba histolytica，E.histolytica)是目前唯一确定的有致病性的内阿米巴原虫，每年可引起五千万人患阿米巴性结肠炎和肝脓肿，造成约十万人死亡，已成为危害全球公共卫生的重要病原之一。
[0003]目前，已报道的可感染猪的内阿米巴属虫种主要有猪内阿米巴原虫(E.suis)和波氏内阿米巴原虫(E.polecki)。虽有报道显示试验条件下猪可感染E.histolytica，但迄今尚未发现猪可自然感染该原虫。研究显示猪内阿米巴原虫主要感染猪，其可侵入猪的肠粘膜固有层引起出血性结肠炎。与猪内阿米巴原虫仅感染猪不同的是，波氏内阿米巴原虫可以感染包括人类、非人灵长类动物、其他哺乳动物以及鸟类等多种宿主。传统上认为波氏内阿米巴原虫是非致病性的，然而最近研究显示，该虫种与其他猪肠道病原共感染时，可加重猪的增生性肠炎病变。因此，需进一步明确猪在内阿米巴原虫的人畜共患传播中的潜在作用，所以，开发内阿米巴原虫的检测方法至关重要。
[0004]临床上猪感染内阿米巴原虫时，往往无临床症状或症状较轻，确诊必须借助实验室诊断。目前检测内阿米巴原虫的方法主要有镜检法、培养法和分子检测法。镜检法和培养法主要是直接对粪便进行镜检或对粪便进行培养后镜检，主要靠观察内阿米巴原虫包囊或滋养体的形态进行判断。但不同的内阿米巴原虫虫种，其包囊或滋养体形态极其相似，在光镜下难以区分，极易造成假阳性结果，因此，目前主要通过分子诊断方法对其进行种类鉴定和基因分型。目前，已发展了一些检测内阿米巴原虫的分子方法，但相关研究主要集中在溶组织内阿米巴原虫，针对其他虫种的分子方法较少，且相关方法大多数每次只能检测一种虫种，费时费力。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种同时检测猪内阿米巴原虫和波氏内阿米巴原虫的双重PCR的引物及方法和应用，特异性地扩增猪内阿米巴原虫和波氏内阿米巴原虫目的片段，与隐孢子虫、蓝氏贾第鞭毛虫、芽囊原虫、毕氏肠微孢子虫、结肠小袋纤毛虫、猪等孢球虫、猪三毛滴虫、猪蛔虫、猪鞭虫和猪类圆线虫等10种猪常见的肠道寄生虫基因组DNA无交叉反应；最低能检查到400fg/μL的阳性对照DNA。
[0006]一种同时检测猪内阿米巴原虫和波氏内阿米巴原虫的双重PCR的引物，包括以下引物：
[0007]猪内阿米巴原虫种特异性引物的上游引物E.suis F和下游引物E.suis R、波氏内阿米巴原虫种特异性引物的上游引物E.polecki F和下游引物E.polecki R；
[0008]所述E.suis F、E.suis R、E.polecki F、E.polecki R的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示。
[0009]一种所述的引物同时检测猪内阿米巴原虫和波氏内阿米巴原虫的双重PCR的方法，包括以下步骤：
[0010]以待检样品基因组DNA为模板，以所述猪内阿米巴原虫种特异性引物和所述波氏内阿米巴原虫种特异性引物为扩增引物进行PCR扩增，电泳；
[0011]若电泳获得大小分别为320bp和600bp的两条目的片段，即同时检测到猪内阿米巴原虫和波氏内阿米巴原虫两种虫种。
[0012]优选的，所述PCR的反应条件为：95℃4min，然后，95℃45s，54℃30s，72℃45s，共35个循环，最后72℃延伸7min。
[0013]优选的，所述的320bp大小的目的片段为猪内阿米巴原虫DNA。
[0014]优选的，所述猪内阿米巴原虫DNA为猪内阿米巴原虫SSU rDNA，核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
[0015]优选的，所述的600bp大小的目的片段为波氏内阿米巴原虫DNA。
[0016]优选的，所述波氏内阿米巴原虫DNA为波氏内阿米巴原虫SSU rDNA，核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
[0017]一种同时检测猪内阿米巴原虫和波氏内阿米巴原虫的双重PCR的方法在同时检测猪粪便中的猪内阿米巴原虫和波氏内阿米巴原虫中的应用。
[0018]优选的，所述方法用于猪的猪内阿米巴原虫和波氏内阿米巴原虫检测。
[0019]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
[0020]1、本专利技术双重PCR方法能特异性地扩增猪内阿米巴原虫和波氏内阿米巴原虫目的片段，与隐孢子虫、蓝氏贾第鞭毛虫、芽囊原虫、毕氏肠微孢子虫、结肠小袋纤毛虫、猪等孢球虫、猪三毛滴虫、猪蛔虫、猪鞭虫和猪类圆线虫等10种猪常见肠道寄生虫的基因组DNA无交叉反应，最低能检查到400fg/μL的阳性对照DNA；
[0021]2、本专利技术提供的一种快速、准确、简便、可直接用于临床中猪粪便猪内阿米巴原虫和波氏内阿米巴原虫同时检测的双重PCR方法，可用于上述两虫的快速检测与鉴别，对于上述虫种的流行病学调查及猪场中的防控等均有重要意义；
[0022]3、本专利技术提供的双重PCR方法特异性高，PCR扩增可检测到1：104稀释的阳性对照DNA，即检测敏感度最低可检测到400fg/μL，双重PCR方法与单项PCR方法的检测结果一致性较好，显著差异(P>0.05)，且本申请的双重PCR方法可显著节省试验时间，降低试验成本。
附图说明
[0023]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以
根据这些附图获得其他的附图。
[0024]图1为本专利技术实施例中猪内阿米巴原虫特异性试验结果；
[0025]其中，各泳道含义如下：M：DL2000 DNA Marker；1：猪内阿米巴原虫；2：隐孢子虫；3：蓝氏贾第鞭毛虫；4：芽囊原虫；5：毕氏肠微孢子虫；6：结肠小袋纤毛虫；7：猪等孢球虫；8：猪三毛滴虫；9：猪蛔虫；10：猪鞭虫；11：猪类圆线虫；12：双蒸水；
[0026]图2为本专利技术实施例中波氏内阿米巴原虫特异性试验结果；
[0027]其中，各泳道含义如下：M：DL2000 DNA Marker；1：波氏内阿米巴原虫；2：隐孢子虫；3：蓝氏贾第鞭毛虫；4：芽囊原虫；5：毕氏肠微孢子虫本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.同时检测猪内阿米巴原虫和波氏内阿米巴原虫的双重PCR的引物，其特征在于，包括以下引物：猪内阿米巴原虫种特异性引物的上游引物E.suis F和下游引物E.suis R、波氏内阿米巴原虫种特异性引物的上游引物E.poleckiF和下游引物E.polecki R；所述E.suis F、E.suis R、E.poleckiF、E.poleckiR的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示。2.权利要求1所述的引物同时检测猪内阿米巴原虫和波氏内阿米巴原虫的双重PCR的方法，其特征在于，包括以下步骤：以待检样品基因组DNA为模板，以所述猪内阿米巴原虫种特异性引物和所述波氏内阿米巴原虫种特异性引物为扩增引物进行PCR扩增，电泳；若电泳获得大小分别为320bp和600bp的两条目的片段，即同时检测到猪内阿米巴原虫和波氏内阿米巴原虫两种虫种。3.根据权利要求2所述的同时检测猪内阿米巴原虫和波氏内阿米巴原虫的双重PCR的方法，其特征在于，所述PCR的反应条件为：95℃4min，然后，95℃45s，54℃30s...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文超，刘欣超，郭伟娜，陈东前，李乔乔，罗昕雨，张恒，潘劲超，顾月月，顾有方，
申请(专利权)人：安徽科技学院，
类型：发明
国别省市：