疟原虫数字PCR快速检测体系及检测方法技术

本申请涉及疟原虫的多重数字PCR快速检测体系及检测方法，可以高灵敏的检出血液中疟原虫的种类和密度，尤其在应用于无症状感染者和低密度水平分析时优势突出，对预防疟原虫感染的漏检、误检效果显著。同时在疟疾伴随诊断中，还可以配合治疗策略的有效调整，更加有效管控药物的使用，加强耐药控制，降低病人的耐药风险。险。

【技术实现步骤摘要】
疟原虫数字PCR快速检测体系及检测方法


[0001]本专利技术涉及疟原虫的多重数字PCR快速检测体系及检测方法。

技术介绍

[0002]疟疾与艾滋病、结核是世界公认的危害人类生命健康的三大公共问题之一，是由疟原虫引起并经按蚊传播的一种寄生虫病。世界卫生组织(WHO)指出2017年全世界有2.19亿疟疾新病例和43.5万例死亡病例。现在全球疟疾的发病主要流行于非洲、亚洲和拉丁美洲的热带和亚热带地区，以非洲的疟疾疫情最为严重。疟原虫进入人体后在肝脏中繁殖，继而感染并破坏血红细胞，不断繁殖、不断破坏，导致人体发病。症状主要表现为周期性规律发作，全身发冷、发热、多汗，长期多次发作后，可引起贫血和脾肿大。凶险型疟疾可出现因脑、肝、肾、心、肺、胃、肠等受损引起的各种综合征，病情严重者会出现谵妄、昏迷和休克等症状，如诊断不及时或治疗不当，可危及生命。疟疾的早期快速诊断有助于及时治疗感染病例，降低死亡率，同时还可用于对献血者的血液筛查分析。寻找快速、简单、高敏感性和高特异性的疟疾检测方法，成为当前疟疾诊断研究的一个重要方面。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供高效筛查疟原虫的PCR引物对、探针、微流控卡盒、试剂盒、检测体系和检测方法，所述PCR引物对、探针、微流控卡盒、试剂盒、检测体系和检测方法可用于任意PCR检测体系，包括但不限于常规PCR、RL
‑
PCR、RNA
‑
PCR、荧光定量PCR、数字PCR、PCR
‑
酶联免疫吸附测定(PCR
‑
ELISA)，巢式PCR
‑
高分辨率熔解分析(nPCR
‑
HRM)等，优选用于数字PCR。
[0004]为达到以上目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0005]项1.一组用于特异性扩增疟原虫基因的PCR引物，其特征在于，所述引物包含如SEQ ID NO:1所示的正向引物、和如SEQ ID NO:2所示的反向引物。
[0006]项2.一组用于特异性筛查三日疟原虫的引物和探针组合，其特征在于，所述引物对包含如SEQ ID NO:1所示的正向引物、如SEQ ID NO:2所示的反向引物，所述探针包含如SEQ ID NO:3所示的探针。
[0007]项3.一组用于特异性筛查卵形疟原虫的引物和探针组合，其特征在于，所述引物对包含如SEQ ID NO:1所示的正向引物、如SEQ ID NO:2所示的反向引物，所述探针包含如SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5所示的探针。
[0008]项4.一组用于特异性筛查恶性疟原虫的引物和探针组合，其特征在于，所述引物对包含如SEQ ID NO:1所示的正向引物、如SEQ ID NO:2所示的反向引物，所述探针包含如SEQ ID NO:6所示的探针。
[0009]项5.一组用于特异性筛查间日疟原虫的引物和探针组合，其特征在于，所述引物对包含如SEQ ID NO:1所示的正向引物、如SEQ ID NO:2所示的反向引物，所述探针包含如SEQ ID NO:7所示的探针。
[0010]项6.一种基于PCR方法筛查或辅助筛查疟原虫的引物和探针组合，其特征在于，所述引物对包含如SEQ ID NO:1所示的正向引物、如SEQ ID NO:2所示的反向引物，所述探针包含如SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:7所示的探针中的任意一条、任意两条、任意三条、任意四条、或五条。
[0011]项7.根据项2
‑
6中任一项所述的引物和探针组合，其特征在于，所述探针序列的5
’
端标记有荧光报告基团，所述探针序列的3
’
端标记有荧光淬灭基团；当所述探针位于同一反应体系时，其中筛选不同种类疟原虫的荧光报告基团光谱范围不同。
[0012]项8.根据项7所述的引物和探针组合，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、ROX、Cy5和/或HEX；所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、和/或Eclipse。
[0013]项9.根据项8所述的引物和探针组合，其特征在于：其中使用的各探针及其5
’
端标记的荧光报告基团和3
’
端标记的荧光淬灭基团如下：
[0014]筛选三日疟原虫的探针如SEQ ID NO:3所示，其5
’
端荧光标记为FAM，3
’
端荧光标记为BHQ1；筛选卵形疟原虫W亚型的探针如SEQ ID NO:4所示，其5
’
端荧光标记为VIC，3
’
端荧光标记为BHQ1；筛选卵形疟原虫C亚型的探针如SEQ ID NO:5所示，其5
’
端荧光标记为VIC，3
’
端荧光标记为BHQ1；筛选恶性疟原虫的探针如SEQ ID NO:6所示，其5
’
端荧光标记为ROX，3
’
端荧光标记为BHQ2；筛选间日疟原虫的探针如SEQ ID NO:7所示，其5
’
端荧光标记为Cy5，3
’
端荧光标记为BHQ3。
[0015]项10.如项6
‑
9任一项所述的引物和探针组合，其为数字PCR(dPCR)反应所用的引物和探针组合。
[0016]项11.一种筛查疟原虫的数字PCR反应预混液，其特征在于，所述PCR反应预混液包含如项1
‑
9任一项所述的引物和/或探针。
[0017]项12.根据项11所述的数字PCR反应预混液，其还包括选自以下的一种、两种、三种、四种或五种组分：热启动Taq酶、UDG酶、dNTPs，牛血清白蛋白和Mg
2+
离子。
[0018]项13.一种数字PCR微流控卡盒，其含有项11或项12所述的数字PCR反应预混液。
[0019]项14.一种用于筛查疟原虫的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如项11或12所述的数字PCR(dPCR)反应预混液。
[0020]项15.根据项14所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括疟原虫阳性对照、和/或阴性对照。
[0021]项16.根据项14所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括项13所述的数字PCR微流控卡盒。
[0022]项17.一种筛查疟原虫的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
[0023](1)处理血浆样品；
[0024](2)制备数字PCR扩增混合液，其含有步骤(1)提供的待检测样本和根据项11或12所述的数字PCR预混液和蒸馏水；
[0025](3)在微流控卡盒内制备微滴，并进行PCR扩增反应；
[0026](4)使用微流控卡盒读取仪进行微滴荧光信号读取；
[0027](5)结果分析。
[0028]项18、根据项1所述的引物、根据项6所述的引物和探针、根据项11或12所述数字PCR反应预混液、或项13所述微流控卡盒在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一组用于特异性扩增疟原虫基因的PCR引物，其特征在于，所述引物包含如SEQ ID NO:1所示的正向引物、和如SEQ ID NO:2所示的反向引物。2.一组用于特异性筛查三日疟原虫的引物和探针组合，其特征在于，所述引物对包含如SEQ ID NO:1所示的正向引物、如SEQ ID NO:2所示的反向引物，所述探针包含如SEQ ID NO:3所示的探针。3.一组用于特异性筛查卵形疟原虫的引物和探针组合，其特征在于，所述引物对包含如SEQ ID NO:1所示的正向引物、如SEQ ID NO:2所示的反向引物，所述探针包含如SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5所示的探针。4.一组用于特异性筛查恶性疟原虫的引物和探针组合，其特征在于，所述引物对包含如SEQ ID NO:1所示的正向引物、如SEQ ID NO:2所示的反向引物，所述探针包含如SEQ ID NO:6所示的探针。5.一组用于特异性筛查间日疟原虫的引物和探针组合，其特征在于，所述引物对包含如SEQ ID NO:1所示的正向引物、如SEQ ID NO:2所示的反向引物，所述探针包含如SEQ ID NO:7所示的探针。6.一种基于PCR方法筛查或辅助筛查疟原虫的引物和探针组合，其特征在于，所述引物对包含如SEQ ID NO:1所示的正向引物、如SEQ ID NO:2所示的反向引物，所述探针包含如SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:7所示的探针中的任意一条、任意两条、任意三条、任意四条、或五条。7.根据权利要求2
‑
6中任一项权利要求所述的引物和探针组合，其特征在于，所述探针序列的5
’
端标记有荧光报告基团，所述探针序列的3
’
端标记有荧光淬灭基团；当所述探针位于同一反应体系时，其中筛选不同种类疟原虫的荧光报告基团光谱范围不同。8.根据权利要求7所述的引物和探针组合，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、ROX、Cy5和/或HEX；所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、和/或Eclipse。9.根据权利要求8所述的引物和探针组合，其特征在于：其中使用的各探针及其5
’
端标记的荧光报告基团和3
’
端标记的荧光淬灭基团如下：筛选三日疟原虫的探针如SEQ ID NO:3所示，其5
’
端荧光标记为FAM，3
’
端荧光标记为...

【专利技术属性】
技术研发人员：关明，蒋浩琴，董柳，张选，王雅琦，张昉，
申请(专利权)人：苏州锐讯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：