快速检测东方蜜蜂微孢子虫的RPA-LFD引物、方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种快速检测东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)的RPA

【技术实现步骤摘要】
快速检测东方蜜蜂微孢子虫的RPA
‑
LFD引物、方法和试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物
，具体而言，本专利技术涉及一种快速检测东方蜜蜂微孢子虫的RPA
‑
LFD引物、方法和试剂盒。

技术介绍

[0002]东方蜜蜂微孢子虫病的病原属于微孢子虫科(Nosematidae)微孢子虫属(Nosema)的成员，被命名为东方蜜蜂微孢子虫。东方蜜蜂微孢子虫属于单细胞真核生物，不能在宿主细胞外繁殖，没有经典的线粒体，但携带有由线粒体衍生的细胞器，称为线粒体残迹，通过利用宿主的能量物质完成自身的快速繁殖。东方蜜蜂微孢子虫具有感染蜂种多、范围广的特点。
[0003]对蜜蜂孢子虫病病原的检测方法有，通过拉取蜜蜂中肠，然后用普通光学显和相差显微镜观察孢子虫(根据孢子大小)，以超微结构中的极丝的螺旋数、直径和孢子大小。用流式细胞仪定量检测活性孢子；用普通PCR和qPCR检测感染率。在养蜂生产中，根据观察蜜蜂感染后的中肠的病变形态等临床症状及用光学显微镜方法诊断，结果均相对滞后且不可靠、检测率低；电镜鉴定方法需要较高的专门操作技术和精密仪器，PCR检测也需要昂贵的仪器且检测的时间较长。现有的东方蜜蜂微孢子虫检测方法由于上述缺陷无法满足疫病现场诊断的需求。研发适合用于东方蜜蜂微孢子虫现场诊断的技术对于有效控制东方蜜蜂微孢子虫流行具有重要意义。
[0004]重组酶聚合酶扩增(RPA)是一种很有前途的等温核酸扩增技术，它依赖于重组酶，单链结合蛋白和链置换DNA聚合酶的组合，在37到42℃的恒定温度下进行20～30min的DNA扩增。该技术依赖重组酶介导引物与目标片段序列结合，使核酸扩增反应脱离了传统PCR反应必须经历的变性、退火和延伸的热循环步骤，进一步触发聚合酶对目标片段进行指数扩增。最佳反应温度在37℃
‑
42℃，反应速度快，10
‑
20分钟即可获得可检出水平的扩增产物。针对RPA扩增产物的检测，实时荧光RPA可对扩增反应进程实时监控，但需要能激发并检测荧光基团的恒温仪器，比如可控温酶标仪或荧光PCR仪；相比而言，试纸条RPA对硬件条件要求更低，只需完成控温扩增反应，随后通过侧向流层析试纸条读取试验结果。因此，试纸条RPA更适合于现场检测的应用。目前，东方蜜蜂微孢子虫检测过程对仪器设备具有依赖性，且无法做到现场快速检测。因此，建立一种快速可靠的诊断方法对东方蜜蜂微孢子虫的预防和控制具有重要的意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的主要目的在于提供一种能够实现现场快速检测东方蜜蜂微孢子虫的RPA核酸等温扩增引物。
[0006]本专利技术还提供了含有上述快速检测东方蜜蜂微孢子虫的RPA恒温扩增引物的试剂盒。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：
[0008]本专利技术提供的一种快速检测东方蜜蜂微孢子虫的RPA
‑
LFD引物，由正向引物和反向引物组成，其核苷酸如下所示：
[0009]正向引物NC
‑
RPA
‑
F:
[0010]5’‑
ATTGTAGTTCCAGCAGTAAACTATGCCGACG
‑3’
(SEQ ID NO：3)；反向引物NC
‑
RPA
‑
R:
[0011]5’‑
biotin
‑
GCCGCACAATCCACTCCTTGTGGTATTCTTCC
‑3’
(SEQ ID NO：4)。
[0012]本专利技术提供的一种快速检测东方蜜蜂微孢子虫的RPA
‑
LFD探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，探针的5
’
端标记了FAM或FITC荧光基团，3
’
端用C3Spacer封闭。
[0013]在本专利技术的一个具体的实施方式中，探针的核苷酸序列如下所示：
[0014]NC
‑
RPA
‑
P：
[0015]5’‑
FAM
‑
CATAATAGAAATTTGAGTTTTTTGGCTCTG
‑
THF
‑
GGATAGTATGATCGC
‑
C3spacer
‑3’
(SEQ ID NO：5)；
[0016]本专利技术提供的一种快速检测东方蜜蜂微孢子虫的RPA
‑
LFD试剂盒，该试剂盒中含有上述所述的引物。
[0017]进一步的，该试剂盒中还含有上述所述的探针
[0018]进一步的，该试剂盒中还含有浓度为280mM的醋酸镁溶液和反应缓冲液Rehydration Buffer、拥挤剂Carbowax 20M、dNTPs、ATP、磷酸肌酸、肌酸激酶，以及重组酶蛋白(T4 uvs X)、单链结合蛋白(T4 gp32)、DNA聚合酶(Bsu)和扩增八连管,同时还有RPA
‑
LFD核酸检测试纸条。
[0019]本专利技术提供的一种快速检测东方蜜蜂微孢子虫的RPA
‑
LFD方法，包括以下步骤：
[0020]1)提取样本核酸；
[0021]2)以提取的核酸为模板，使用引物NC
‑
RPA
‑
F和NC
‑
RPA
‑
R，以及探针
[0022]NC
‑
RPA
‑
P进行RPA反应；
[0023]3)将上述反应得到的RPA反应产物用无菌水稀释，得到稀释液；
[0024]4)将稀释液滴在RPA
‑
LFD核酸检测试纸条上，确定样品中是否含有东方蜜蜂微孢子虫；其中，RPA
‑
LFD核酸检测试纸条可检测RPA反应产物是否携带荧光标记和生物素Biotin标记。
[0025]RPA
‑
LFD核酸检测试纸条下端为结合垫，中间为NC膜，上端为吸收垫。其中结合垫上有胶体金颗粒，且颗粒上标记抗FAM荧光基团的抗体，NC膜上的质控线标记抗FAM抗体的二抗抗体，检测线标记抗生物素抗体。RPA反应产物携带FAM荧光标记和生物素标记，因此，该试纸条检测其为阳性。
[0026]当检测试纸条在质控区和检测区均出现红色条带，则结果显示为阳性，表明样品中含有东方蜜蜂微孢子虫；当检测试纸条检测区无条带，而质控区有条带，则结果显示为阴性，表明样品中不含有东方蜜蜂微孢子虫。若质控线和检测线均无条带出现，表明试纸条失效。
[0027]进一步的，步骤(2)中的RPA反应体系为：
[0028][0029][0030]进一步的，步骤(2)中的RPA反应条件为：39
‑
42℃反应20
‑
30min。优选39℃，20min。
[0031]进一步的，所述检测试纸条为抗荧光标记的检测试纸条本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速检测东方蜜蜂微孢子虫的RPA
‑
LFD引物，由正向引物和反向引物组成，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。2.根据权利要求1所述的RPA
‑
LFD引物，其特征在于，所述的反向引物的5
′
端用生物素Biotin标记。3.一种快速检测东方蜜蜂微孢子虫的RPA
‑
LFD探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。4.根据权利要求3所述的RPA
‑
LFD探针，其特征在于，探针的5
’
端标记了FAM或FITC荧光基团，3
’
端用C3Spacer封闭。5.一种快速检测东方蜜蜂微孢子虫的RPA
‑
LFD试剂盒，其特征在于，该试剂盒中包含权利要求1或2所述的RPA
‑
LFD引物和权利要求3或4所述的RPA
‑
LFD探针。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中还含有浓度为280mM的醋酸镁溶液和反应缓冲液Rehydration Buffer、拥挤剂Carbowax 20M、dNTPs、ATP、磷酸肌酸、肌酸激酶、重组酶蛋白、单链...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨卅，邓炎春，侯春生，代平礼，
申请(专利权)人：中国农业科学院蜜蜂研究所，
类型：发明
国别省市：