能够屏蔽死亡菌体DNA的乳酸杆菌的活菌计数方法技术

本发明专利技术涉及乳酸杆菌活菌计数技术领域，具体地说，涉及能够屏蔽死亡菌体DNA的乳酸杆菌的活菌计数方法。其包括以下步骤：选择培养基和染色液；菌种活化、培养与稀释；对乳酸杆菌进行有效活菌染色判定，采用FDA染色与革兰氏染色双染法对乳酸杆菌进行染色，判定菌体的活性和菌种；双染后的乳酸杆菌采用平板计数法进行活菌计数；设备清洗。采用FDA染色与革兰氏染色双染法实现对乳酸杆菌的活菌进行计数，通过对乳酸杆菌数中的死亡菌体DNA进行屏蔽，通过对活菌进行染色分辨，可提高乳酸杆菌计数的有效精度。精度。精度。

【技术实现步骤摘要】
能够屏蔽死亡菌体DNA的乳酸杆菌的活菌计数方法


[0001]本专利技术涉及乳酸杆菌活菌计数
，具体地说，涉及能够屏蔽死亡菌体DNA的乳酸杆菌的活菌计数方法。

技术介绍

[0002]乳酸杆菌在维护人和高等动物机体健康方面具有重要的作用。在营养生理方面，乳酸杆菌可提高蛋白质、乳糖和钙等营养物质的消化吸收，可产生多种维生素为机体消化吸收所利用；可抑制肠道内腐败菌、致病菌的繁殖，降低血氨和血中胆固醇的含量，并具有维持肠道内菌群平衡的整肠作用。
[0003]乳酸杆菌在食品、饮料、饲料和医药等多个领域获得广泛的应用，而评价乳酸杆菌产品品质的指标之一就是产品中的活菌数，平板菌落计数法是常用的微生物计数方法，现有复合菌中乳酸菌的分离计数多采用MRS培养基，但有的乳酸杆菌存在自然衰亡的现象，在传统平板菌落计数法中，由于试验环境等因素影响，乳酸杆菌会迅速繁殖和死亡，死亡的乳酸杆菌其营养价值也会降低，乳酸杆菌的部分死亡会干扰乳酸杆菌的有效计数，因此需要能够屏蔽死亡菌体DNA的乳酸杆菌的活菌计数方法，来准确测定乳酸杆菌中的活菌数量。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供能够屏蔽死亡菌体DNA的乳酸杆菌的活菌计数方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供能够屏蔽死亡菌体DNA的乳酸杆菌的活菌计数方法，包括以下步骤：
[0006]S1：选择培养基和染色液；
[0007]S2：菌种活化、培养与稀释；
[0008]S3：对乳酸杆菌进行有效活菌染色判定，采用FDA染色与革兰氏染色双染法对乳酸杆菌进行染色，判定菌体的活性和菌种；
[0009]S4：双染后的乳酸杆菌采用平板计数法进行活菌计数；
[0010]S5：设备清洗。
[0011]作为本技术方案的进一步改进，所述S1中，所述培养基为MRS培养基、TJA培养基和ATP培养基中的任意一种，所述染色液包括用于测定细胞活性的FDA染色液和用于区分乳酸杆菌的革兰氏染色液。
[0012]作为本技术方案的进一步改进，所述S2中，所述乳酸杆菌通过培养基在37℃温度环境下活化，使菌体液活力达107[0013]CFU/mL；并制成多组不同的10倍递增稀释液(使用灭菌生理盐水进行稀释)，从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与培养基混合、培养。
[0014]作为本技术方案的进一步改进，制备10倍递增稀释液时，在超净工作台内用灭菌的1.5ml离心管，按10倍比稀释法稀释，用移液器吸取上述混悬液100ul，注入含有900ul缓
冲液的离心管内，并在液体中反复吹打5次，在漩涡振荡器上震荡30s混匀。
[0015]作为本技术方案的进一步改进，所述S3中，FDA染色与革兰氏染色双染法具体染色步骤为：
[0016]S3.1：取干净载玻片，取出培养的稀释液，使用FDA染色液对其进行初染，在室温黑暗处静置5min染色，判定并检测细胞活性；
[0017]S3.2：静置后的稀释液，使用革兰氏染色液进行复染；来判断、区分乳酸杆菌；
[0018]S3.3：将染色后的稀释液进行镜检、计数。
[0019]作为本技术方案的进一步改进，所述S4中，所述平板计数法具体试验步骤为：
[0020]S4.1：选择多个稀释度，每个稀释度取1ml菌液，加9ml生理盐水混匀；
[0021]S4.2：在混匀后的菌液中再取1ml菌液，加9ml生理盐水进行二次稀释；
[0022]S4.3：将二次稀释后的菌液滴取置于载玻片上，在显微镜下观察；
[0023]S4.4：观察并记下平板的菌落总数后，计算出原始样品中的菌落数，求出平均菌落数，其中，菌落数计算公式如下：
[0024][0025]式中：N为样品中菌落数；∑C为平板菌落数之和；n1为第一稀释度平板个数；n2为第二稀释度平板个数；d为稀释因子(第一稀释度)。
[0026]S4.5：在显微镜下观察，载玻片面积1cm2，每次平均观察20
‑
30个视野后代入计数公式，对菌液中活菌数进行计算，计算公式为：
[0027][0028]作为本技术方案的进一步改进，所述S4.3中，滴取置于载玻片上的菌液为10ul，菌液滴取至灭菌平皿上，每个稀释度做3个平行，计算平皿同一稀释度3个平行组的菌落平均数。
[0029]作为本技术方案的进一步改进，所述S4.3中，在载玻片中加入0.001％一氯化三苯基四氮唑(TTC)，防止菌落蔓延。
[0030]与现有技术相比，本专利技术的有益效果：
[0031]该能够屏蔽死亡菌体DNA的乳酸杆菌的活菌计数方法中，采用FDA染色与革兰氏染色双染法实现对乳酸杆菌的活菌进行计数，通过对乳酸杆菌数中的死亡菌体DNA进行屏蔽，通过对活菌进行染色分辨，可提高乳酸杆菌计数的有效精度。
附图说明
[0032]图1为实施例1的整体流程框图。
具体实施方式
[0033]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他
实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0034]实施例1
[0035]请参阅图1所示，本实施例能够屏蔽死亡菌体DNA的乳酸杆菌的活菌计数方法，包括以下步骤：
[0036]S1：选择培养基和染色液；
[0037]其中，培养基为MRS培养基、TJA培养基和ATP培养基中的任意一种，染色液包括用于测定细胞活性的FDA染色液和用于区分乳酸杆菌的革兰氏染色液；
[0038]S2：菌种活化、培养与稀释；将实验室保藏的发酵乳杆菌用活化培养基37℃活化数次，使乳酸杆菌的活力满足实验标准，种子液活力需达107[0039]CFU/mL，即得实验用的活化菌种，活化后置4℃冰箱保存备用；
[0040]将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合、培养；制成多组不同的10倍递增稀释液，使用灭菌生理盐水进行稀释，从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与培养基混合、培养；进一步的，在制备10倍递增稀释液时，在超净工作台内用灭菌的1.5ml离心管，按10倍比稀释法稀释，用移液器吸取上述混悬液100ul，注入含有900ul缓冲液的离心管内，并在液体中反复吹打5次，在漩涡振荡器上震荡30s混匀；每次稀释时更换枪头及充分震荡混匀，以保证菌液完全稀释。
[0041]S3：对乳酸杆菌进行有效活菌染色判定，采用FDA染色与革兰氏染色双染法对乳酸杆菌进行染色，判定菌体的活性和菌种；
[0042]其中，FDA染色与革兰氏染色双染法具体染色步骤为：
[0043]S3.1：取干净载玻片，取出培养的稀释液，使用FDA染色液对其进行初染，在室温黑暗处静置5min染色；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.能够屏蔽死亡菌体DNA的乳酸杆菌的活菌计数方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：选择培养基和染色液；S2：菌种活化、培养与稀释；S3：对乳酸杆菌进行有效活菌染色判定，采用FDA染色与革兰氏染色双染法对乳酸杆菌进行染色，判定菌体的活性和菌种；S4：双染后的乳酸杆菌采用平板计数法进行活菌计数；S5：设备清洗。2.根据权利要求1所述的能够屏蔽死亡菌体DNA的乳酸杆菌的活菌计数方法，其特征在于：所述S1中，所述培养基为MRS培养基、TJA培养基和ATP培养基中的任意一种，所述染色液包括用于测定细胞活性的FDA染色液和用于区分乳酸杆菌的革兰氏染色液。3.根据权利要求1所述的能够屏蔽死亡菌体DNA的乳酸杆菌的活菌计数方法，其特征在于：所述S2中，所述乳酸杆菌通过培养基在37℃温度环境下活化，使菌体液活力达107CFU/mL；制成多组不同的10倍递增稀释液，从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与培养基混合、培养。4.根据权利要求3所述的能够屏蔽死亡菌体DNA的乳酸杆菌的活菌计数方法，其特征在于：制备10倍递增稀释液时，在超净工作台内用灭菌的1.5ml离心管，按10倍比稀释法稀释，用移液器吸取上述混悬液100ul，注入含有900ul缓冲液的离心管内，并在液体中反复吹打5次，在漩涡振荡器上震荡30s混匀。5.根据权利要求1所述的能够屏蔽死亡菌体DNA的乳酸杆菌的活菌计数方法，其特征在于：所述S3中，FDA染色与革兰氏染色双染法具体染色步骤为：S3.1：取干净载玻片，取出培养的稀释液，使用FDA染色液...

【专利技术属性】
技术研发人员：周元元，邹勇平，李奇，王帅，胡云，杨嘉，卢伟，何旭东，
申请(专利权)人：扬州市食品药品检验检测中心，
类型：发明
国别省市：