一种功能化固相微萃取探针及其在河鲀鱼毒素活体检测中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种功能化固相微萃取探针及其在河鲀鱼毒素活体检测中的应用，该探针由氧化石墨烯

【技术实现步骤摘要】
一种功能化固相微萃取探针及其在河鲀鱼毒素活体检测中的应用


[0001]本专利技术涉及生物检测领域，具体涉及一种功能化固相微萃取探针及其在河鲀鱼毒素活体检测中的应用。

技术介绍

[0002]我国河鲀鱼食用历史悠久，是河鲀鱼的产销大国，拥有丰富的河鲀鱼资源。然而，河鲀鱼在生长过程中容易受到环境中各类污染物的侵袭从而在体内积聚河鲀鱼毒素，对河鲀鱼的食用安全产生严重威胁。而且，河鲀鱼毒素有较高的稳定性，一般的烹饪方法很难将其破坏，且中毒后尚无针对性的解毒剂或抗毒素。因此，用科学有效的方法检测河鲀鱼中的河鲀鱼毒素，从而避免河鲀鱼毒素中毒事件的发生非常重要。现有的河鲀鱼毒素检测方法包括小鼠生物法、免疫检测法、仪器分析法等，仍存在一些不足之处。例如，中国专利技术专利申请(公布号：CN201410603308.5)公开“免疫亲和柱净化
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液相色谱
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串联质谱测定海洋生物中河豚毒素的方法”，利用免疫亲和柱的独特选择识别性和液相色谱
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串联质谱的高灵敏性和精确性，测定海洋生物中的河鲀鱼毒素，但不足之处在于：在前处理过程中需要使用溶剂提取河鲀鱼毒素，并用免疫亲和柱进行净化，步骤繁琐且免疫亲和柱也需要经过十天以上才能制备完成，比较耗时，而且检测过程对样品具有致死性。中国专利技术专利申请(公布号：CN201410251894.1)公开“一种河豚毒素检测试剂盒”，利用免疫增强乳胶比浊法快速简便地检测河鲀鱼毒素，实现大批量检测，但不足之处在于：需要将样品解刨均质后测定，破坏了河鲀鱼较高的经济价值，并且与河鲀鱼毒素单克隆抗体相结合的纳米乳胶颗粒制备过程也较繁琐。因此，寻找一种河鲀鱼毒素快速简便的活体检测方法很有必要。
[0003]固相微萃取(SPME)技术是一种相对新型的无溶剂萃取方法，集采集、分离和富集于一体，是一种方便快捷与绿色环保的样品前处理技术。SPME对整个样品体系的影响较小，可以用于检测或分析活体动物中的目标组分。例如，中国专利技术专利申请(公布号：CN112547030A) 公开“一种超交联聚合物纳米颗粒固相微萃取生物相容性探针及其在活体分析中的应用”，含有超交联聚合物纳米颗粒和聚去甲肾上腺素生物相容涂层的石英纤维作为固相微萃取探针用于植物活体中农药残留分析，同样探针的制备过程比较繁琐。基于SPME技术在活体检测中的优势，急需构建一种河鲀鱼毒素的活体检测方法探究河鲀鱼毒素在鱼体内的残留水平，且现有技术中尚未有基于固相微萃取技术活体检测河鲀鱼毒素的相关报道。

技术实现思路

[0004]针对现有技术中检测河鲀鱼毒素存在准备时间长、检测成本高和样品致死性方面的不足，本专利技术主要目的在于提供一种功能化固相微萃取探针，灵敏度高且成本低。
[0005]本专利技术另一目的在于提供上述功能化固相微萃取探针的制备方法，通过浸渍法制备得到。
[0006]本专利技术再一目的在于提供上述功能化固相微萃取探针在河鲀鱼毒素活体检测中的应用，准备时间短、灵敏度高且检测成本低，有效避免检测河鲀鱼毒素导致的样品致死性问题。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]第一方面，本专利技术提供一种功能化固相微萃取探针，其通过氧化石墨烯
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聚丙烯腈溶液涂覆于活化不锈钢针上并由去甲肾上腺素溶液在其表面自发聚合形成PNE涂层得到，其中：
[0009]所述GO
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PAN溶液由氧化石墨烯(GO)溶于聚丙烯腈(PAN)胶中制成，制备方法包括：将质量比为1:7
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8的PAN固体和N,N
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二甲基甲酰胺(DMF)混合，充分搅拌使PAN分散均匀并适当溶解形成粘稠的悬浊液，在80
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100℃加热50
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70min，使PAN完全溶解于DMF形成黄色澄清透明的PAN胶，冷却至室温；取GO粉末加入DMF中超声分散均匀，两者质量体积比为15
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25mg：200
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300μL，得到的GO溶液加入到上述PAN胶，搅拌均匀；
[0010]所述活化不锈钢针由直径0.4
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0.6mm的医用不锈钢针剪成2
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3cm长的小段，依次在浓盐酸中超声预处理8
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12min、取出和去离子水润洗的表面活化处理得到。
[0011]第二方面，本专利技术提供上述功能化固相微萃取探针的制备方法，通过浸渍法制备得到，包括：所述活化不锈钢针一端垂直浸入所述GO
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PAN溶液，缓慢取出，在80
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100℃加热2
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4 min，至DMF充分挥发使涂层固定，重复数次上述浸入和加热步骤，使涂层均匀包裹在所述活化不锈钢针上，浸入所述NE溶液中在其表面自发聚合24h，取出，去离子水冲洗即得；所述NE溶液的浓度为0.2mg/mL，通过NE溶解在10mM pH 8.5的Tri缓冲液和甲醇的混合溶液(1:1，v/v)中不断搅拌使其溶解而成。
[0012]优选地，所述功能化固相微萃取探针的表面涂层厚度为50
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70μm。
[0013]第三方面，本专利技术提供上述功能化固相微萃取探针在河鲀鱼毒素活体检测中的应用。
[0014]优选地，所述功能化固相微萃取探针在河鲀鱼肌肉中对河鲀鱼毒素的检出限为32ng/g，定量限为150ng/g，线性范围为50
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1000ng/g。
[0015]优选地，所述功能化固相微萃取探针进行河鲀鱼毒素活体检测的方法，包括以下步骤：
[0016](1)用丁香酚将活体河鲀鱼进行麻醉；
[0017](2)用医用注射器针在鱼鳍附近的背部肌肉侧面扎一个1.5cm深度的小孔；
[0018](3)将医用注射器针从小孔中拔出，所述功能化固相微萃取探针插入小孔中进行活体萃取；
[0019](4)将上述河鲀鱼从水中捞出，再次麻醉后取出所述功能化固相微萃取探针；
[0020](5)先用去离子水冲洗所述功能化固相微萃取探针，再用脱附溶剂对萃取到的河鲀鱼毒素进行脱附；
[0021](6)步骤(5)中的脱附液进行LC
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MS/MS分析，获得鱼体内的河鲀鱼毒素含量。
[0022]优选地，步骤(1)和(4)中，麻醉河鲀鱼的方法为：将5mL丁香酚液体加入5L自来水中，配制成0.1％丁香酚(体积分数)水溶液，从水中将河鲀鱼捞起浸入到上述溶液中，数秒后其身体失去平衡后立即将鱼捞出，完成麻醉。
[0023]优选地，步骤(3)中，所述活体萃取的时间为30
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70min。
[0024]优选地，步骤(5)中，所述脱附溶剂选自甲醇、50％甲醇、乙腈和50％乙腈，脱附时间为20
–
40min。
[0025]优选地，步骤(6)中，所述LC
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MS/MS分析的条件为：使用日本岛津公司的超高效液相色谱
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三重四极杆质谱联本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种功能化固相微萃取探针，其特征在于，其通过氧化石墨烯
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聚丙烯腈溶液涂覆于活化不锈钢针上并由去甲肾上腺素溶液在其表面自发聚合形成PNE涂层得到，其中：所述氧化石墨烯
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聚丙烯腈溶液由氧化石墨烯溶于聚丙烯腈胶中制成，制备方法包括：将质量比为1:7
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8的聚丙烯腈固体和N,N
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二甲基甲酰胺混合，充分搅拌使聚丙烯腈分散均匀并适当溶解形成粘稠的悬浊液，在80
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100℃加热50
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70min使聚丙烯腈完全溶解形成黄色澄清透明的聚丙烯腈胶，冷却至室温；取氧化石墨烯粉末加入到N,N
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二甲基甲酰胺中超声分散均匀，两者质量体积比为15
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25mg：200
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300μL，得到的氧化石墨烯溶液加入到上述聚丙烯腈胶，搅拌均匀；所述活化不锈钢针通过直径0.4
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0.6mm的医用不锈钢针剪成2
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3cm长的小段，依次在浓盐酸中超声预处理8
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12min、取出和去离子水润洗的表面活化处理得到。2.根据权利要求1所述的功能化固相微萃取探针，其特征在于，包括：所述活化不锈钢针一端垂直浸入所述氧化石墨烯
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聚丙烯腈溶液，缓慢取出，在80
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100℃加热2
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4min，至N,N
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二甲基甲酰胺充分挥发使涂层固定，重复数次上述浸入和加热步骤，使涂层均匀包裹在所述活化不锈钢针上，浸入浓度为0.2mg/mL的去甲肾上腺素溶液中自发聚合24h，取出，用去离子水冲洗即得；其中，所述去甲肾上腺素溶液通过去甲肾上腺素溶解在10mM pH 8.5的Tri缓冲液和甲醇的混合溶液(1:1，v/v)中不断搅拌使其溶解而成。3.根据权利要求2所述的功能化固相微萃取探针，其特征在于，所述功能化固相微萃取探针的表面涂层厚度为50
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70μm。4.权利要求1至3任一项所述功能化固相微萃取探针在河鲀鱼毒素活体检测中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述功能化固相微萃取探针在河鲀鱼肌肉中对河鲀鱼毒素的检出限为32ng/g，定量限为150ng/g，线性范围为50
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1000ng/g。6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，通过所述功能化固相微萃取...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘源，孟恒立，姜水，胡云，
申请(专利权)人：扬州市食品药品检验检测中心，
类型：发明
国别省市：