一种基于RPA-Cas12a的双靶点检测耐药沙门氏菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于RPA

【技术实现步骤摘要】
一种基于RPA
‑
Cas12a的双靶点检测耐药沙门氏菌的方法


[0001]本专利技术属于沙门氏菌检测
，具体涉及一种基于RPA
‑
Cas12a的双靶点检测耐药沙门氏菌的方法。

技术介绍

[0002]沙门氏菌是引起人类肠胃炎和死亡的最重要的传染性肠道病原体之一。尽管一些加工程序和一些规范的操作流程降低了沙门氏菌污染的风险，但是沙门氏菌的流行并没有停止，沙门氏菌抗性的出现进一步增加了安全风险。快速、灵敏、高通量地检测食品中的耐药沙门氏菌已成为一种迫切的需求。
[0003]目前常用的沙门氏菌检测方法为细菌培养法，该方法需要花费5～7天，耗时费力。而一些快速检测方法，例如酶联免疫法，以及利用电化学生物传感器、光学生物传感器、侧流分析试纸条等来快速检测沙门氏菌，然而上述快速检测方法在检测灵敏度以及准确度方面存在不足。
[0004]核酸扩增以其高灵敏度用于食源性致病菌的检测，如聚合酶链式反应(PCR)，环介导等温扩增技术(LAMP)和重组聚合酶扩增技术(RPA)等。PCR通常需要复杂的温控程序，LAMP和RPA等方法比PCR方法更加快速、灵敏和方便。
[0005]Cas12a是CRISPR
‑
Cas家族的一类蛋白，在crRNA的引导下，可以特异性识别双链DNA，并激发出对单链DNA的反式切割活性。若单链DNA被荧光素标记，即可通过测定荧光强度来判断DNA的含量及菌的浓度。
[0006]然而，目前的细菌培养检测沙门氏菌的方法存在检测时间长，操作复杂，检测灵敏度低等问题，而核酸扩增方法检测沙门氏菌易受气溶胶污染而呈现假阳性结果。

技术实现思路

[0007]本专利技术针对所要解决的技术问题，克服现有技术的不足而提供一种基于RPA
‑
Cas12a的双靶点检测耐药沙门氏菌的方法，该方法通过一个带圆盖的Ep管将扩增过程和Cas12a检测过程集中在一个体系中，实现快速灵敏检测的同时可减少气溶胶污染，提高检测的准确性。
[0008]本专利技术的目的之一在于，提供一种基于RPA
‑
Cas12a的双靶点检测耐药沙门氏菌的方法，包括以下步骤：
[0009]步骤1、将耐药沙门氏菌过夜培养，清洗后加热裂解，离心提取上清液，即DNA提取液，作为后续扩增的底物；
[0010]步骤2、将步骤1的DNA提取液，RPA冻干粉，引物和RPA扩增所需缓冲液置于带管盖的Ep管底部，并将Cas12a检测液置于管盖中暂时储存；
[0011]步骤3、将步骤2的Ep管平放，扩增，然后将管盖内的Cas12a检测液通过短暂离心的方式流至管底，与管底的扩增液混合；
[0012]步骤4、步骤3的Ep管孵育一段时间后，对反应产物进行荧光检测。
[0013]本专利技术涉及RPA扩增，Cas12a检测体系及沙门氏菌双靶点检测，耐药检测等，由于invA是沙门氏菌属的特异性基因，其作为检测指标的可行性已被多项研究验证，而多粘菌素是临床上对抗耐药菌的最后一道防线，多粘菌素的耐药与mcr
‑
1基因有着重要关系。因此，本专利技术选用invA和mcr
‑
1作为检测对象。
[0014]本专利技术进一步优化的技术方案如下：
[0015]所述步骤2中的引物为invA基因和mcr
‑
1的引物，其制备方法如下：
[0016](1)将耐药沙门氏菌过夜培养，清洗后加热裂解，提取上清液，即DNA提取液，作为后续扩增的底物；
[0017](2)设计三对invA引物和mcr
‑
1引物，通过RPA实验进行筛选，即将步骤(1)的DNA提取液，RPA冻干粉，所设计的引物和RPA扩增所需缓冲液置于Ep管中进行扩增，所述invA引物的序列为：
[0018]invA
‑
RPA
‑
F1：5
’‑
ACCCATTTGTATTGGTTGTTACGGCTATTTTG
‑3’
，
[0019]invA
‑
RPA
‑
R1：5
’‑
TCGCCAATCAGTCCTAACGACGACCCTTCTTT
‑3’
，
[0020]invA
‑
RPA
‑
F2：5
’‑
ACCCATTTGTATTGGTTGTTACGGCTATTTTG
‑3’
，
[0021]invA
‑
RPA
‑
R2：5
’‑
GCGGCTGCTCGCCTTTGCTGGTTTTAGGTTTG
‑3’
，
[0022]invA
‑
RPA
–
F3：5
’‑
CCATTTGTATTGGTTGTTACGGCTATTTTGAC
‑3’
，
[0023]invA
‑
RPA
–
R3：5
’‑
GTTTTAGGTTTGGCGGCGCTACGTT
‑3’
，
[0024]所述mcr
‑
1引物的序列为：
[0025]mcr
‑1‑
RPA
‑
F1：5
’‑
CAATGCCTATGATGTCTCAATGCTGTAT
‑3’
，
[0026]mcr
‑1‑
RPA
‑
R1：5
’‑
GGCGTGATGCCAGTTTGCTTATCCGTCC
‑3’
，
[0027]mcr
‑1‑
RPA
–
F2：5
’‑
CAATGCCTATGATGTCTCAATGCTGTATGT
‑3’
，
[0028]mcr
‑1‑
RPA
–
R2：5
’‑
ATCGCGTCATGGGTCAGGACGGTATCGGTT
‑3’
，
[0029]mcr
‑1‑
RPA
–
F3：5
’‑
CAATGCCTATGATGTCTCAATGCTGTAT
‑3’
，
[0030]mcr
‑1‑
RPA
–
R3：5
’‑
GCTTATCCGTCCAGAAAAATGCAGGCAC
‑3’
；
[0031](3)对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳测定，筛选得到最终引物，其中invA的最终引物序列为：
[0032]invA
‑
RPA
‑
F2：5
’‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于RPA
‑
Cas12a的双靶点检测耐药沙门氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、将耐药沙门氏菌过夜培养，清洗后加热裂解，离心提取上清液，即DNA提取液，作为后续扩增的底物；步骤2、将步骤1的DNA提取液，RPA冻干粉，引物和RPA扩增所需缓冲液置于带管盖的Ep管底部，并将Cas12a检测液置于管盖中暂时储存；步骤3、将步骤2的Ep管平放，扩增，然后将管盖内的Cas12a检测液通过短暂离心的方式流至管底，与管底的扩增液混合；步骤4、步骤3的Ep管孵育一段时间后，对反应产物进行荧光检测。2.根据权利要求1所述一种基于RPA
‑
Cas12a的双靶点检测耐药沙门氏菌的方法，其特征在于，所述步骤2中的引物为invA基因和mcr
‑
1的引物，其制备方法如下：（1）将耐药沙门氏菌过夜培养，清洗后加热裂解，提取上清液，即DNA提取液，作为后续扩增的底物；（2）设计三对invA引物和mcr
‑
1引物，通过RPA实验进行筛选，即将步骤（1）的DNA提取液，RPA冻干粉，所设计的引物和RPA扩增所需缓冲液置于Ep管中进行扩增，所述 invA引物的序列为：invA
‑
RPA
ꢀ‑
F1：5
’‑
ACCCATTTGTATTGGTTGTTACGGCTATTTTG
‑3’
，invA
‑
RPA
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R1：5
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TCGCCAATCAGTCCTAACGACGACCCTTCTTT
‑3’
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RPA
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ACCCATTTGTATTGGTTGTTACGGCTATTTTG
ꢀ‑3’
，invA
‑
RPA
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R2：5
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，invA
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RPA
ꢀ–
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ꢀ‑3’
，invA
‑
RPA
ꢀ–
R3：5
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GTTTTAGGTTTGGCGGCGCTACGTT
ꢀ‑3’
，所述mcr
‑
1引物的序列为：mcr
‑1‑
RPA
ꢀ‑
F1：5
’‑ꢀ
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ꢀ‑3’
，mcr
‑1‑
RPA
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R1：5
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，mcr
‑1‑
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CAATGCCTATGATGTCTCAATGCTGTATGT
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，mcr
‑1‑
RPA
ꢀ–
R2：5
’‑ꢀ
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ꢀ‑3’
，mcr
‑1‑
RPA
ꢀ–
F3：5
’‑ꢀ
CAATGCCTATGATGTCTCAATGCTGTAT

【专利技术属性】
技术研发人员：杨嘉，周元元，朱庆丽，王帅，邹勇平，储广烨，胡云，卢伟，
申请(专利权)人：扬州市食品药品检验检测中心，
类型：发明
国别省市：