一种基于平板涂布接种的烟草中霉菌检测方法技术

本发明专利技术涉及一种基于平板涂布接种的烟草中霉菌检测方法，属于微生物检验计数技术领域。该检测方法将样品梯度稀释液按照不高于400μL/平板的接种量接种到至少一个平板上，可实现对烟草中霉菌的检测。该检测方法可确保样品梯度稀释液全覆盖培养基平板表面，且无样液自由流动，利于培养基快速吸收，最大限度提高样液接种量以尽可能多的对样液进行检测，结果统计简单且各重复平板间能够形成对照以验证检测重复性。基于平板涂布接种的烟草中霉菌检测方法具有霉菌检出率高、易判读和计数、菌落分布均匀、利于后期分离纯化、操作过程简单、对检验人员技术要求不高、适合大批量样品检测等优点，对烤烟烟叶、雪茄烟叶和雪茄烟支均适用。用。用。

【技术实现步骤摘要】
一种基于平板涂布接种的烟草中霉菌检测方法


[0001]本专利技术涉及一种基于平板涂布接种的烟草中霉菌检测方法，属于微生物检验计数


技术介绍

[0002]霉菌种类多、繁殖力强、繁殖方式多样，在烟草中常有发现。由其引发的霉变现象，更是会导致烟草品质、色泽、风味等发生变化，造成严重的经济损失。有些霉菌还会产生霉菌毒素，威胁人体健康，影响烟草的质量安全性。但由于视觉霉变的滞后性，霉菌危害早期防控的关键在于如何快速、准确地发现样品中霉菌的出现和繁殖，而霉菌计数是开展各项研究的基础，决定着研究结果的可靠性。因此，开展烟草中霉菌计数，对于预防和监控霉变发生具有重大意义。
[0003]传统的霉菌计数的微生物学方法中，所采用的样品接种方式为平板倾注接种，但平板倾注接种在实际操作过程中对检测人员的专业要求较高，需要具备一定的操作经验，接种培养后的平板上霉菌菌落因接种液与培养基的混合易在培养基内部的不同空间内生长，且菌落分布不均匀，不利于霉菌计数。

技术实现思路

[0004]为解决上述存在的问题，本专利技术提供了一种基于平板涂布接种的烟草中霉菌检测方法。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
[0006]一种基于平板涂布接种的烟草中霉菌检测方法，包括以下步骤：
[0007]S1、样品预处理：在烟草样品中加入无菌磷酸盐缓冲液，均质后进行稀释，得到稀释液样品；
[0008]S2、培养基倒入培养皿中，待凝固后得到平板，将所述稀释液样品接种到凝固后的培养基上；针对直径为90mm的培养皿，接种量不高于400μL/平板；
[0009]S3、使用无菌涂布棒均匀涂抹培养基表面稀释液样品，室温放置培养基至表面水分晾干；
[0010]S4、密封后于恒温恒湿箱正置培养，正置培养开始观察并计数，最终烟草样品中霉菌总数的结果由计数公式计算得出，计数公式为：m为平板重复数；n为平板总个数个数，n≥2；Qi为每个平板上的霉菌含量；T为稀释倍数；N为n个平板的总接种量。
[0011]相较于平板倾注培养法，平板涂布接种法不仅操作过程简单，且操作条件易于控制，无需控制培养基温度，培养基平板可提前制备，更加适合大批量样品霉菌计数。且平板涂布接种法霉菌菌落均生长于培养基表面，菌落分布均匀，利于霉菌生长、判读和计数，也利于后期霉菌分离纯化，对烤烟烟叶、雪茄烟叶和雪茄烟支均适用。
[0012]优选地，针对直径为90mm的培养皿，接种量为200～400μL/平板。
[0013]本专利技术单个平板的接种量是针对直径为90mm的培养皿优化获得的，如果使用与本专利技术直径不同的培养皿，接种量需等比例放大或缩小。
[0014]进一步优选地，针对直径为90mm的培养皿，将接种总量设置为1mL，采用333μL、333μL、334μL的接种量分别接种到三个平板上，此时计数公式为：m为平板重复数，Qi为每个平板上的霉菌含量，T为稀释倍数。
[0015]优选地，步骤S1中烟草与无菌磷酸盐缓冲液的质量体积比为1:9。
[0016]优选地，步骤S1中稀释为梯度稀释，范围为10
‑1～10
‑6。
[0017]优选地，步骤S2中培养基为孟加拉红琼脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基或改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基。
[0018]优选地，步骤S3中的无菌涂布棒为无菌L型无菌涂布棒。
[0019]进一步优选地，所述的无菌L型无菌涂布棒为3个含培养基的培养皿共用。
[0020]优选地，步骤S4中密封后的培养基在28℃、75％湿度条件下正置培养。
[0021]优选地，步骤S4中正置培养3天。
附图说明
[0022]图1为本专利技术平板涂布接种法的操作示意图；
[0023]图2为本专利技术实验例5、实验例8、实验例11中平板涂布接种法对雪茄烟支中霉菌计数的影响图；
[0024]图3为本专利技术实验例5、实验例8、实验例11中平板倾注接种法对雪茄烟支中霉菌计数的影响图。
具体实施方式
[0025]基于平板涂布接种的烟草霉菌检测方法的操作示意图如图1所示，具体操作步骤如下：
[0026]S1、样品预处理：在烟草样品中加入无菌磷酸盐缓冲液，均质后进行稀释，得到稀释液样品；
[0027]S2、培养基倒入培养皿中，待凝固后得到平板，将所述稀释液样品接种到凝固后的培养基上；针对直径为90mm的培养皿，接种量不高于400μL/平板；
[0028]S3、使用无菌涂布棒均匀涂抹培养基表面稀释液样品，室温放置培养基至表面水分晾干；
[0029]S4、密封后于恒温恒湿箱正置培养，正置培养开始观察并计数，最终烟草样品中霉菌总数的结果由计数公式计算得出，计数公式为：m为平板重复数；n为平板总个数个数，n≥2；Qi为每个平板上的霉菌含量；T为稀释倍数；N为n个平板的总接种量。
[0030]步骤S1中吸取适量均质后的样品梯度稀释后，稀释范围为10
‑1～10
‑6，一般烟草样
品在此稀释度内即可选择出合适的稀释倍数进行后续计数，但是也可以根据实际样品对稀释倍数进行实际调整，以满足计数需要。
[0031]步骤S2中可以在霉菌计数之前准备好所用的孟加拉红琼脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基或改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基，每一个稀释梯度的稀释样品按照不高于400uL/平板的接种量接种到至少两个平板上，但是考虑稀释样品在培养基上覆盖度及误差等问题，每一个稀释梯度的稀释样品量最好不少于200μL/平板。
[0032]步骤S3中使用同一个无菌L型无菌涂布棒均匀涂抹n个培养基表面稀释液样品，室温晾至25
‑
30min，观察培养基表面无明显水分即可。
[0033]步骤S4中密封后的培养基在28℃、75％湿度条件下正置培养，3天后开始观察，选取霉菌大小均匀、数量合适的稀释度的培养基进行最终计数。
[0034]下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此；若无特殊说明，实施例中所用的各类试剂、仪器等均为市售商品。
[0035]实施例一
[0036]本实施例采用黑曲霉定量质控菌株对平板涂布接种的接种量及接种平板数进行优化。
[0037]实验例1单平板黑曲霉孢子悬浮液接种量
[0038]取出黑曲霉冻干粉瓶，往冻干粉里添加2mL复苏液，用振荡器震荡5s，以便充分溶解并形成均匀的菌悬液，此时含菌量为3.0
×
106CFU/mL，然后以此孢子悬浮液为母液，添加无菌磷酸缓冲液依次稀释并制成10
‑4、10
‑5、10
‑6梯度稀释液。取各梯度稀释液5μL、10μL、20μL、50μL、100μL、200μL、300μL、333μL、400μL、500μL、800μL、1000μL，分别加入到按照《GB 4789.15—2016食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》制备的马铃薯葡本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于平板涂布接种的烟草中霉菌检测方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、样品预处理：在烟草样品中加入无菌磷酸盐缓冲液，均质后进行稀释，得到稀释液样品；S2、培养基倒入培养皿中，待凝固后得到平板，将所述稀释液样品接种到凝固后的培养基上；针对直径为90mm的培养皿，接种量不高于400μL/平板；S3、使用无菌涂布棒均匀涂抹培养基表面稀释液样品，室温放置培养基至表面水分晾干；S4、密封后于恒温恒湿箱正置培养，正置培养开始观察并计数，最终烟草样品中霉菌总数的结果由计数公式计算得出，计数公式为：霉菌含量m为平板重复数；n为平板总个数，n≥2；Qi为每个平板上的霉菌含量；T为稀释倍数；N为n个平板的总接种量。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：针对直径为90mm的培养皿，接种量为200～400μL/平板。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：针对直径为90mm的培养皿，将接种总量设置为1mL，采用333μL、333μL、334...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄阔，叶长文，薛芳，朱贝贝，李栋，李东亮，范黎，李青常，刘丹丹，陈宸，杨国涛，贺琛，
申请(专利权)人：四川中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：