猪源抗菌短肽的筛选法制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及猪源抗菌短肽的筛选及初步验证。本发明专利技术公开了一种猪源细菌性疾病的新型抗菌制剂——猪源GSDMD抗菌肽。通过构建以pET

【技术实现步骤摘要】
猪源抗菌短肽的筛选法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及猪源抗菌短肽的筛选及初步验证。

技术介绍

[0002]对于养猪业来说，细菌性疾病是制约其发展的重要因素，对养猪业造成了重大的经济损失。目前，防控细菌性疾病的主要手段是使用抗生素，但抗生素的长期使用造成了细菌耐药性增加等问题。自相应的全面禁抗措施实施以来，对于非抗生素抗菌药物的研发迫在眉睫。
[0003]Gasdermin D(GSDMD)是Gasdermin蛋白家族的成员之一，由N端和C端结构域构成，静止情况下呈自抑制状态。经炎性Caspase
‑
1/4/5/11切割后，形成有较强细胞和细菌毒性的GSDMD
‑
N蛋白。GSDMD
‑
N能够特异性识别并结合磷脂酰肌醇和心磷脂，在生物膜上成孔而引起细胞焦亡，其中细胞焦亡是一种细胞程序性调控的裂解性死亡，是机体的非特异性防御机制之一，以细胞膜成孔、细胞肿胀破裂及细胞内容物外漏为特征。由于磷脂酰肌醇仅存在于真核细胞膜内层，而心磷脂为原核细胞细菌膜的组分之一，故GSDMD
‑
N能够分别从真核细胞膜内和细菌膜外在生物膜上寡聚化形成孔道，从而引起生物膜的裂解和细胞的死亡，已有的试验证明，人源的GSDMD
‑
N具有从胞外杀灭大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及李斯特菌等细菌的能力。但由于GSDMD
‑
N的细胞毒性过高，无法获得纯化的GSDMD
‑
N蛋白，故需要进一步筛选具有杀菌能力且对于真核细胞没有明显细胞毒性的GSDMD截短片段。已有研究表明，人源性的GSDMD截短片段在体外具有杀菌作用，但对于猪GSDMD蛋白的抗菌效果及其应用尚未进行发掘。

技术实现思路

[0004]本专利技术要解决的技术问题是筛选出猪源性的GSDMD抗菌短肽并初步验证其作用，为新型的高效、安全、无耐药性的抗菌制剂研发提供理论基础。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种猪源抗菌短肽的筛选法(猪源抗菌短肽的筛选及初步验证方法)：
[0006]构建猪GSDMD的原核表达质粒和猪GSDMD截短片段原核表达质粒；将上述质粒分别转化至BL21 pLysS感受态细胞，在IPTG诱导下表达，通过OD
570
和OD
620
测定及菌落平板计数检测获得具有杀菌作用的猪源抗菌短肽。
[0007]本专利技术的猪源抗菌短肽的筛选及初步验证方法，具体如下：
[0008]构建猪的原核表达质粒pET
‑
28a
‑
SUMO
‑
GSDMD
‑
FL和pET
‑
28a
‑
SUMO
‑
GSDMD
‑
N以及猪的GSDMD截短片段原核表达质粒pET
‑
28a
‑
SUMO
‑
GSDMD
‑
60
‑
90、；pET
‑
28a
‑
SUMO
‑
GSDMD
‑
70
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90、pET
‑
28a
‑
SUMO
‑
GSDMD
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80
‑
90、pET
‑
28a
‑
SUMO
‑
GSDMD
‑
185
‑
245、pET
‑
28a
‑
SUMO
‑
GSDMD
‑
205
‑
245、pET
‑
28a
‑
SUMO
‑
GSDMD
‑
225
‑
245。
[0009]将上述8个质粒分别转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞，在IPTG诱导下表达，通过OD
570
和OD
620
测定及菌落平板计数检测到猪GSDMD
‑
N与猪GSDMD
‑
60
‑
90位氨基酸片段具有杀
菌作用。
[0010]作为本专利技术的猪源抗菌短肽的筛选及初步验证方法的改进：
[0011]原核表达质粒转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞中，转化产物涂于含卡那霉素的平板过夜培养后挑取单菌落小摇进行甘油保菌，同时按照1：100的比例取新鲜菌液加入含有卡那霉素的BHI培养基中，37℃、180rpm培养至OD
570
＝0.4
‑
0.6。取其中2ml菌液作为未诱导对比，向剩余菌液中加入终浓度0.5mM的IPTG，15℃、140rpm诱导过夜。菌液用于OD值测定、菌落平板计数和SDS
‑
PAGE检测，结果显示，猪GSDMD
‑
N与猪GSDMD
‑
60
‑
90位氨基酸片段具有杀菌作用。
[0012]作为本专利技术的猪源抗菌短肽的筛选及初步验证方法的进一步改进：
[0013]构建对应的猪的真核表达质粒C
‑
p3
×
Flag
‑
CMV
‑
14
‑
GSDMD
‑
FL和C
‑
p3
×
Flag
‑
CMV
‑
14
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GSDMD
‑
N以及猪的GSDMD截短片段真核表达质粒C
‑
p3
×
Flag
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CMV
‑
14
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GSDMD
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60
‑
90、C
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p3
×
Flag
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CMV
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14
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GSDMD
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70
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90、C
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p3
×
Flag
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CMV
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14
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GSDMD
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80
‑
90、C
‑
p3
×
Flag
‑
CMV
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14
‑
GSDMD
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185
‑
245、C
‑
p3
×
Flag
‑
CMV
‑
14
‑
GSDMD
‑
205
‑
245、C
‑
p3
×...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.猪源抗菌短肽的筛选法，其特征是：构建猪GSDMD的原核表达质粒和猪GSDMD截短片段原核表达质粒；将上述质粒分别转化至BL21 pLysS感受态细胞，在IPTG诱导下表达，通过OD
570
和OD
620
测定及菌落平板计数检测获得具有杀菌作用的猪源抗菌短肽。2.根据权利要求1所述的猪源抗菌短肽的筛选及初步验证方法，其特征是：所述猪GSDMD的原核表达质粒为：pET
‑
28a
‑
SUMO
‑
GSDMD
‑
FL、pET
‑
28a
‑
SUMO
‑
GSDMD
‑
N；所述猪GSDMD截短片段原核表达质粒为：pET
‑
28a
‑
SUMO
‑
GSDMD
‑
60
‑
90、pET
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28a
‑
SUMO
‑
GSDMD
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70
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90、pET
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28a
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SUMO
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GSDMD
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80
‑
90、pET
‑
28a
‑
SUMO
‑
GSDMD
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185
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245、pET
‑
28a
‑
SUMO
‑
GSDMD
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205
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245、pET
‑
28a
‑
SUMO
‑
GSDMD
‑
225
‑
245；将上述8个质粒分别转化至BL21 pLysS感受态细胞，在IPTG诱导下表达，通过OD
570
和OD
620
测定及菌落平板计数检测到猪GSDMD
‑
N与猪GSDMD
‑
60
‑
90位氨基酸片段具有杀菌作用。3.根据权利要求1或2所述的猪源抗菌短肽的筛选及初步验证方法，其特征是：原核表达质粒转化至BL21 pLysS感受态细胞中，转化产物涂于含卡那霉素的平板过夜培养后挑取单菌落摇菌进行甘油保菌，同时按照1：100的比例取菌液加入含有卡那霉素的BHI培养基中，37℃、180rpm培养至OD
570
＝0.4
‑
0.6；取其中2ml菌液作为未诱导对比，向剩余菌液中加入终浓度0.5mM的IPTG，15℃、140rpm诱导过夜；菌液用于OD值测定、菌落平板计数和SDS
‑
PAGE检测，结果显示，猪GSDMD
‑
N与猪GSDMD
‑
60
‑
90位氨基酸片段具有杀菌作用。4.根据权利要求3所述的猪源抗菌短肽的筛选及初步验证方法，其特征是：构建对应的猪的真核表达质粒和猪GSDMD截短片段真核表达质粒；所述猪的真核表达质粒为：C
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p3
×
Flag
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CMV
‑
14
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GSDMD
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FL和C
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p3
×
Flag
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CMV
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14
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GSDMD
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【专利技术属性】
技术研发人员：师福山，李丹月，傅心雨，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：