一种提高磷脂酶D热稳定性的定向进化方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了一种提高磷脂酶D热稳定性的定向进化方法，本方案通过AutoDock Vina将PLD(2ZE4)分别与底物PC和L

【技术实现步骤摘要】
一种提高磷脂酶D热稳定性的定向进化方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种提高磷脂酶D热稳定性的定向进化方法。

技术介绍

[0002]磷脂(Phospholipids)是含有磷酸基化合物的统称，分子结构由2条疏水长碳链和1个极性头部组成。磷脂最早被发现于蛋黄中，是生命体细胞膜的主要组成成分，广泛分布于动植物的各种细胞组织内，承担着信号传导和促进新陈代谢的重任。磷脂的主要生理活性功能是由它的极性头部决定的，根据极性头部的种类，磷脂可以被分为：磷脂酰胆碱(Phatidylcholine，PC)、磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylerhanolamine，PE)、磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)、磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol，PI)、磷脂酰甘油(Phosphatidylglycerol，PG)等。虽然磷脂在自然界分布广泛，种类繁多，但是这些磷脂在自然界中分布却十分不均匀。其中，PS是存在于细胞膜上必不可少的活性物质，可以调控膜蛋白可以被人体快速吸收，高效穿越脑血屏障，安全地减缓甚至修复人脑中神经细胞的受损细胞膜。从而达到改善患者认知能力，学习能力和记忆能力的功效，对阿尔兹海默症的治疗具有一定的辅助作用。主要从大豆中提取获得，也存在于大脑细胞和花生中。在动物中，PS主要存在于大脑和肝脏的细胞中，由于动物容易染病使产品的安全性受到了威胁；在植物中，磷脂含量较多的是PC，相对而言，PS的含量很少，提取困难。所以，利用酶转化法合成PS应运而生，具有操作稳定、高度专一性等优势。
[0003]磷脂酶D(PLD)是特殊的磷脂水解酶，能够催化磷脂水解，释放原来磷脂的极性头部，生成磷脂酸(PA)。此外，在含有第二底物(亲核试剂，如丝氨酸，乙醇胺，甘油等)条件下，磷脂酶D能够催化裂解磷脂磷酸二酯键发生断裂，并促进磷酰基与亲核试剂结合，生成新的磷脂。PLD催化的磷脂酰基转移反应是目前使用最为广泛，也是最有效的PS人工合成方法。
[0004]但是，目前已知的PLD磷脂酰基转移活力，反应选择性和稳定性都有待提高。分子对接(Molecular Docking)技术研究底物与酶结合的可能性，配合分子动力学(Molecular Dynamics)模拟确定结合复合物稳定性，进一步通过底物与酶结合自由能计算(Binding Free Energies Analysis)判断反应进行的方向和程度。利用蛋白质理性设计，可以最大程度降低定点突变的实验工作量，考虑每个突变位点都有20种突变情况(19种替换突变和1种删除突变)，利用生物分子模拟技术可以虚拟筛选突变体文库，大大提高实际突变效率。但是，目前关于虚拟突变提高PLD催化性能的研究几乎没有报道，导致PLD定点突变研究缺乏方向性。

技术实现思路

[0005]本专利技术意在提供一种提高磷脂酶D热稳定性的定向进化方法，以提高PLD的催化性能。
[0006]为达到上述目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种磷脂酶D的突变蛋白，对磷脂酶D的氨基酸序列进行点突变，所
述磷脂酶的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列；所述突变的点位为：G381M、A122M、A122L或R377M。
[0008]本专利技术还提供了一种表达上述突变蛋白的重组菌。
[0009]优选的，作为一种改进，所述重组菌的基础菌株包括大肠杆菌。
[0010]本专利技术还提供了上述重组菌的构建方法，包括以下步骤：
[0011](1)培养野生型E.coli TOP10/pBADKP
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PLD2，其中载体为质粒pBADKP，宿主细胞为E.coli TOP10，具体构建方法见专利CN109136207B；
[0012](2)利用PlasmidMini KitⅠ试剂盒从菌株E.coli TOP10/pBADKP
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PLD2中提取含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列编码基因的质粒pBADKP，将质粒pBADKP作为突变PCR的模板；
[0013](3)利用定点突变引物对质粒进行PCR扩增，得到扩增产物；
[0014](4)利用DpnⅠ酶消化扩增产物未突变的模板DNA，得到消化产物；
[0015](5)将消化产物用热激发导入E.coli top10感受态细胞，通过含有卡那霉素抗性的LB固体培养基进行单克隆的筛选，得到所述重组菌。
[0016]优选的，作为一种改进，步骤(3)所述的定点突变引物包括：针对G381M点突的突变引物G381M
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F和G381M
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R，所述G381M
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F的核苷酸序列如包括SEQ ID NO.2所示，所述G381M
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R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
[0017]针对A122M点突的突变引物A122M
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F和D175L
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R，所述A122M
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F的核苷酸序列如包括SEQ ID NO.4所示，所述A122M
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R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
[0018]针对A122L点突的突变引物A122L
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F和A122L
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R，所述A122L
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F的核苷酸序列如包括SEQ ID NO.6所示，所述A122L
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R的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
[0019]针对R377M点突的突变引物R377M
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F和R377M
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R，所述R377M
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F的核苷酸序列如包括SEQ ID NO.8所示，所述R377M
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R的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
[0020]优选的，作为一种改进，所述步骤(1)培养野生型E.coli TOP10/pBADKP
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PLD2具体步骤包括：取培E.coli TOP10/pBADKP
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PLD2冰冻菌液利用LB培养基于37℃，200rpm条件下培养12h。
[0021]优选的，作为一种改进，所述LB培养基为：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L和氯化钠10g/L。
[0022]优选的，作为一种改进，所述步骤(4)具体步骤为：加入2μL的DpnⅠ于37℃反应1.5h消化未突变的模板DNA，得到消化产物。
[0023]优选的，作为一种改进，步骤(3)所述PCR扩增程序包括：98℃预变性5min；98℃变性10s，55～65℃退火30s，72℃延伸2min，以1min/kb进行延伸，30循环；72℃延伸10min；4℃保持。
[0024]本专利技术还提供了上述磷脂酶D表达重组菌制备磷脂酶D的方法，包括以下步骤：所述磷脂酶D表达重组菌用LB培养基复苏后，转接于TB培养基中培养5
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6h，再转接至T本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种磷脂酶D的突变蛋白，对磷脂酶D的氨基酸序列进行点突变，所述磷脂酶的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列；所述突变的点位为：G381M、A122M、A122L或R377M。2.一种表达权利要求1所述突变蛋白的重组菌。3.根据权利要求2所述重组菌的基础菌株包括大肠杆菌。4.根据权利要求2或3重组菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)培养野生型E.coli TOP10/pBADKP
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PLD2，其中载体为质粒pBADKP，宿主细胞为E.coli TOP10，具体构建方法见专利CN109136207B；(2)利用Plasmid Mini KitⅠ试剂盒从菌株E.coli TOP10/pBADKP
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PLD2中提取含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列编码基因的质粒pBADKP，将质粒pBADKP作为突变PCR的模板；(3)利用定点突变引物对质粒进行PCR扩增，得到扩增产物；(4)利用DpnⅠ酶消化扩增产物未突变的模板DNA，得到消化产物；(5)将消化产物用热激发导入E.coli top10感受态细胞，通过含有卡那霉素抗性的LB固体培养基进行单克隆的筛选，得到所述重组菌。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)所述的定点突变引物包括：针对G381M点突的突变引物G381M
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F和G381M
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R，所述G381M
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F的核苷酸序列如包括SEQ ID NO.2所示，所述G381M
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R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；针对A122M点突的突变引物A122M
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F和D175L
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R，所述A122M
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F的核苷酸序列如包括SEQ ID NO.4所示，所述A122M
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R...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵旭蕊，林颖珺，林秀芬，张慧兰，卢英华，林嘉扬，
申请(专利权)人：厦门蓝湾科技有限公司，
类型：发明
国别省市：