【技术实现步骤摘要】
一种提高磷脂酶D合成PS活性的理性定向进化方法
[0001]本专利技术涉及生物
,具体涉及一种提高磷脂酶D合成PS活性的理性定向进化方法。
技术介绍
[0002]磷脂(Phospholipids)是含有磷酸基化合物的统称,分子结构由2条疏水长碳链和1个极性头部组成。磷脂最早被发现于蛋黄中,是生命体细胞膜的主要组成成分,广泛分布于动植物的各种细胞组织内,承担着信号传导和促进新陈代谢的重任。磷脂的主要生理活性功能是由它的极性头部决定的,根据极性头部的种类,磷脂可以被分为:磷脂酰胆碱(Phatidylcholine,PC)、磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylerhanolamine,PE)、磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)、磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol,PI)、磷脂酰甘油(Phosphatidylglycerol,PG)等。虽然磷脂在自然界分布广泛,种类繁多,但是这些磷脂在自然界中分布却十分不均匀。其中,PS是存在于细胞膜上必不可少的活性物质,可以调控膜蛋白可以被人体快速吸收,高效穿越脑血屏障,安全地减缓甚至修复人脑中神经细胞的受损细胞膜。从而达到改善患者认知能力,学习能力和记忆能力的功效,对阿尔兹海默症的治疗具有一定的辅助作用。主要从大豆中提取获得,也存在于大脑细胞和花生中。在动物中,PS主要存在于大脑和肝脏的细胞中,由于动物容易染病使产品的安全性受到了威胁;在植物中,磷脂含量较多的是PC,相对而言,PS的含量很少,提取困难。所以,利用酶转化法合成PS应运而生, ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种磷脂酶D的突变蛋白,对磷脂酶D的氨基酸序列进行点突变,所述磷脂酶的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列;所述突变的点位为:Y135A、Y135I、T181A、T181I、Q387A、Q387I、D392A、D392I、和T194I中的一个或多个组合。2.一种表达权利要求1所述突变蛋白的重组菌。3.根据权利要求2所述重组菌的基础菌株包括大肠杆菌。4.根据权利要求2或3重组菌的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)培养野生型E.coli TOP10/pBADKP
‑
PLD2,其中载体为质粒pBADKP,宿主细胞为E.coli TOP10,具体构建方法见专利CN109136207B;(2)利用Plasmid Mini KitⅠ试剂盒从菌株E.coli TOP10/pBADKP
‑
PLD2中提取含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列编码基因的质粒pBADKP,将质粒pBADKP作为突变PCR的模板;(3)利用定点突变引物对质粒进行PCR扩增,得到扩增产物;(4)利用DpnⅠ酶消化扩增产物未突变的模板DNA,得到消化产物;(5)将消化产物用热激发导入E.coli top10感受态细胞,通过含有卡那霉素抗性的LB固体培养基进行单克隆的筛选,得到所述重组菌。5.根据权利要求4所述的构建方法,其特征在于,步骤(3)所述的定点突变引物包括:针对Y135A点突的突变引物Y135A
‑
F和Y135A
‑
R,所述Y135A
‑
F的核苷酸序列如包括SEQ ID NO.2所示,所述Y135A
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;针对Y135I点突的突变引物Y135I
‑
F和Y135I
‑
R,所述Y135I
‑
F的核苷酸序列如包括SEQ ID NO.4所示,所述Y135I
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示;针对T181A点突的突变引物T181A
‑
F和T181A
‑
R,所述T181A
‑
F的核苷酸序列如包括SEQ ID NO.6所示,所述T181A
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示;针对T181I点突的突变引物T181I
‑
F和T181L
‑
R,所述T181I
‑
F的核苷酸序列如包括SEQ ID NO.8所示,所述T181I
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示;针对Q387A点突的突变引物Q387A
‑
F和Q387A
‑
R,所述Q387A
‑
F的核苷酸...
【专利技术属性】
技术研发人员:赵旭蕊,林颖珺,林秀芬,张倩,韩尧跃,卢英华,
申请(专利权)人:厦门蓝湾科技有限公司,
类型:发明
国别省市:
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。