本发明专利技术提供了一种基于TbAgo的核酸切割体系及靶标核酸分子的检测方法和试剂盒，靶标核酸分子的检测方法包括向含有待检靶标核酸分子的反应体系中加入Ago蛋白、向导DNA、核酸探针，反应完成后对其进行检测。该方法可用于快速检测病原微生物、基因突变和特异靶标DNA等。基因突变和特异靶标DNA等。基因突变和特异靶标DNA等。
【技术实现步骤摘要】
一种基于TbAgo的核酸切割体系及靶标核酸分子的检测方法和试剂盒
[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种基于新型中高温Argonaute蛋白 TbAgo的核酸切割体系及由此开发的靶标核酸分子的检测方法和试剂盒。
技术介绍
[0002]核酸检测技术已被广泛的应用于各种领域，如生物分子医学诊断、食品安全检测、环境监测、病原微生物检测、基因分型等。
[0003]尽管传统核酸检测技术，如定量聚合酶链式反应(qPCR)、高通量测序、DNA 印迹(southern blot)等仍被广泛应用，但这些技术均有缺陷，如费用昂贵、耗时较久且需专业人员操作等。
[0004]近年来，CRISPR/Cas体系，即规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关基因(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPRassociated gene，CRISPR/Cas)成为研究的热点，基于该体系的核酸检测技术也不断被开发，如SHERLOCK、DETECTOR、HOLMES等，虽然相较传统核酸检测技术更经济、便捷，但仍具有一定缺陷。如Cas蛋白对靶标核酸分子的识别与切割需依赖PAM位点，使得其可作用的位点受限；Cas蛋白需在向导RNA (gRNA)介导下才能发挥功能，而RNA不仅生产过程复杂，价格昂贵，而且易被环境中的核酸酶降解，使得整个体系稳定性较差；Cas蛋白在识别、结合特定核酸后被激发的反式切割活性为非特异性核酸酶活性，因此基于此开发的核酸检测技术无法达到单一体系检测多个靶标核酸分子的要求。
[0005]综上，仍须开发一种检测位点不受限、体系稳定并且可同时检测多个靶标核酸分子的核酸检测新技术。
[0006]Argonaute(Ago)蛋白最早在一项描述拟南芥突变体的研究中被提及。目前已报道的Ago蛋白主要分为真核Ago(eAgo)和原核Ago(pAgo)两类。eAgo在真核生物中是RNA干扰(RNAi)途径的关键参与者，可以在转录后调节基因表达，从而防御入侵的RNA病毒并保护基因组的完整性。而pAgo可以结合单链的向导 DNA(gDNA)或向导RNA(gRNA)，对与向导核酸序列互补的DNA或RNA 在特定位点进行切割，即在从向导核酸5
’
端起的第10和第11位之间产生切割，被认为可能也是原核生物的一种免疫机制。
[0007]目前仅有极少数的pAgo被表征，这些Ago蛋白多为高温Ago,可在高温下结合单链gDNA或gRNA，切割单链DNA或单链RNA。相较CRISPR/Cas体系，pAgo对靶标核酸分子链进行切割时不依赖PAM位点，因此可通过对gDNA 的设计，达到对任意序列的核酸进行切割的目的；而gDNA则比gRNA具有更好的稳定性；同时由于切割行为需依赖gDNA的特定序列，因此在单一反应体系内的多个切割反应互不干扰，可达到单一体系同时检测多个靶标核酸分子的目的。
[0008]基于现有核酸检测技术的缺点和pAgo体系的特点，开发新型基于pAgo蛋白的核酸检测技术具有重要的现实意义和广阔的应用前景。
技术实现思路
[0009]在本专利技术的第一方面，提供了一种核酸切割体系。
[0010]所述核酸切割体系包括：
[0011](a)可编程核酸内切酶Argonaute(Ago)；所述的可编程核酸内切酶 Argonaute来源于嗜热菌(Thermus brockianus)，所述的可编程核酸内切酶 Argonaute是可编程核酸内切酶TbAgo。
[0012](b)向导DNA(gDNA)；和
[0013](c)核酸探针，其中若所述核酸探针被切割，所述的切割是可以被检测出的。
[0014]在另一优选例中，所述核酸切割体系的反应温度为50℃
‑
95℃，较佳地为 50℃
‑
85℃，更佳地为50℃
‑
75℃。
[0015]在另一优选例中，所述的TbAgo包括野生型和突变型的TbAgo。所述TbAgo 与如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有至少80％同一性。
[0016]在另一优选例中，所述野生型TbAgo的氨基酸序列如NCBI序列号 WP_071678161.1所示。
[0017]在另一优选例中，所述的gDNA是5
’
端磷酸化或5
’
端羟基化的单链DNA分子。
[0018]在另一优选例中，所述的gDNA是5
’
端磷酸化的单链DNA分子。
[0019]在另一优选例中，所述的gDNA与所述核酸探针之间具有反向互补的片段，可引导TbAgo切割核酸探针，产生可被检出的信号值。
[0020]在另一优选例中，所述的gDNA的长度为10nt
‑
35nt，更佳地14nt
‑
35nt。
[0021]在另一优选例中，所述的核酸探针是单链DNA(ssDNA)。
[0022]在另一优选例中，所述的核酸探针是未经修饰的单链DNA。
[0023]在另一优选例中，当所述核酸探针被切割，所述的切割能够通过电泳法被检测出。
[0024]在另一优选例中，所述的电泳法是用14％的核酸Urea
‑
PAG电泳检测法。
[0025]在另一优选例中，所述的核酸探针是仅5
’
端修饰荧光基团的单链DNA分子，所述的荧光基团是FAM。
[0026]在另一优选例中，所述核酸探针是同时带有荧光基团和淬灭基团的核酸探针。
[0027]在另一优选例中，所述荧光基团包括：FAM、HEX、CY5、CY3、VIC、JOE、 TET、5
‑
TAMRA、ROX、Texas Red
‑
X，或其组合。
[0028]在另一优选例中，所述猝灭基团包括：BHQ、TAMRA、DABCYL、DDQ，或其组合。
[0029]在另一优选例中，所述的荧光基团和淬灭基团各自独立地位于所述核酸探针的5
’
端与3
’
端。
[0030]在另一优选例中，当所述核酸探针被切割，所述的切割能够通过酶标仪被检测出。
[0031]在另一优选例中，所述核酸探针是同时带有荧光基团和生物素基团的核酸探针，所述的荧光基团是FAM。
[0032]在另一优选例中，所述的荧光基团和生物素基团各自独立地位于所述核酸探针的5
’
端与3
’
端。
[0033]在另一优选例中，当所述核酸探针被切割，所述的切割能够通过胶体金试纸条被检测出。
[0034]在另一优选例中，所述的核酸切割体系还包含：(d)二价金属离子。
[0035]在另一优选例中，所述的二价金属离子为Mn
2+
、Mg
2+
、Ca
2+
、Co
2+...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种核酸切割体系，其特征在于，所述核酸切割体系包括：(a)可编程核酸内切酶Ago；所述的可编程核酸内切酶Ago来源于嗜热菌，所述的可编程核酸内切酶Ago是可编程核酸内切酶TbAgo；(b)向导DNA(gDNA)；和(c)核酸探针，其中若所述核酸探针被切割，所述的切割是可以被检测出的。2.如权利要求1所述的核酸切割体系，其特征在于，所述TbAgo与如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有至少80％同一性。3.如权利要求1所述的核酸切割体系，其特征在于，所述的核酸探针包括带有可检测标记的单链DNA。4.一种靶标核酸分子的检测体系，其特征在于，所述检测体系含有如权利要求1、2、3中的任一所述的核酸切割体系。...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐志南，方蒙君，黄迪，
申请(专利权)人：杭州孚斯泰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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