lncRNACACF吸附miR-106a在制备人脐静脉内皮细胞自噬诱导剂中的应用制造技术

本发明专利技术公开了lncRNACACF吸附miR

【技术实现步骤摘要】
lncRNACACF吸附miR
‑
106a在制备人脐静脉内皮细胞自噬诱导剂中的应用


[0001]本专利技术属于细胞工程和基因工程
，具体涉及lncRNA CACF吸附miR
‑
106a在制备人脐静脉内皮细胞自噬诱导剂中的应用。

技术介绍

[0002]心肌梗死(Myocardial Infarction，MI)是一种严重危害人类健康的心血管疾病。促进MI后的血管新生能改善MI后的心脏功能。新生的血管是从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展而来，主要包括血管内皮细胞的增殖、出芽和迁移。自噬是将细胞内受损的蛋白质及细胞器运输到溶酶体进行消化降解的过程，是细胞的自我更新，能防止损伤的蛋白质及细胞器的积累，现有研究认为，促进细胞自噬能改善心肌梗死后心功能恢复。
[0003]长链非编码RNA(Long Non
‑
coding RNA，lncRNA)是一类长度超过200nt的非编码RNA，可作为重要调节因子参与到包括MI在内的各种疾病的发生和/或发展中。研究表明，lncRNA可以通过竞争性吸附miRNA，抑制微小核糖核酸(microRNA，miRNA)对mRNA的降解作用，进而发挥其生理功能。lncRNA CACF(Cardiac autophagy contributory factor，暂命名)测序编号为lncRNA XLOC_083933在心肌梗死后促进人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的增殖和血管成型。但其对HUVECs细胞自噬的调控尚没有报道。
[0004]miRNA是一类内源性非编码单链小分子RNA，长度约为22个核苷酸，可通过与信使核糖核酸(Messenger Ribonucleic Acid，mRNA)的3
’
非翻译区(untranslated region，UTR)不同程度的互补配对，诱导靶基因mRNA降解或抑制翻译，从而在转录后水平调控靶基因的表达。现有研究表明miR
‑
106a在多种癌细胞中通过调控细胞自噬来发挥作用，但目前尚无关于miR
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106a对人脐静脉内皮细胞自噬调控的相关报道。

技术实现思路

[0005]为解决相关问题，本专利技术的首要目的在于提供lncRNA CACF在制备人脐静脉内皮细胞自噬诱导剂中的应用。
[0006]本专利技术的另一目的在于提供miR
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106a在制备人脐静脉内皮细胞自噬抑制剂中的应用。
[0007]本专利技术的再一目的在于提供lncRNA CACF吸附miR
‑
106a在制备人脐静脉内皮细胞自噬诱导剂中的应用。
[0008]为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0009]lncRNA CACF在制备人脐静脉内皮细胞自噬诱导剂中的应用，体外环境下，lncRNA CACF正调控人脐静脉内皮细胞自噬；通过调节lncRNA CACF的表达水平，可实现人脐静脉内皮细胞自噬调控；所述的lncRNA CACF如SEQ ID NO：1所示。
[0010]进一步地，增加外源性lncRNA CACF，人脐静脉内皮细胞自噬小体增加；抑制lncRNA CACF的表达，人脐静脉内皮细胞自噬小体减少。
[0011]进一步地，所述的lncRNA CACF通过竞争性吸附miR
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106a，实现人脐静脉内皮细胞自噬调控。
[0012]miR
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106a在制备人脐静脉内皮细胞自噬抑制剂中的应用，体外环境下，miR
‑
106a负调控人脐静脉内皮细胞自噬；通过调节miR
‑
106a的表达水平，可实现人脐静脉内皮细胞自噬调控。
[0013]进一步地，增加外源性miR
‑
106a，人脐静脉内皮细胞自噬小体减少；抑制miR
‑
106a表达，人脐静脉内皮细胞自噬小体增加。
[0014]进一步地，上述应用中：
[0015]所述的增加外源性lncRNA CACF通过基因过表达技术实现，采用的基因过表达载体通过如下方式制备得到：
[0016](1)提取人脐静脉内皮细胞的RNA，将其逆转录成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，得到目的片段；
[0017](2)将目的片段连接到用限制性内切酶BamH I和Xba I酶切后的pcDNA3.1载体上，得到重组载体。
[0018]步骤(1)中进行PCR扩增所用引物如下所示：
[0019]PCR
‑
CACFForward：5
′‑
GGGGTACCCCTCACGGAAAGGGGCGG
‑3′
；
[0020]PCR
‑
CACF Reverse：5
′‑
GGAATTCGCCCGGCATGGGGGAC
‑3′
。
[0021]所述的抑制lncRNA CACF表达降低通过反义寡核苷酸实现，反义寡核苷酸序列如下：
[0022]5′‑
CGAAUCCACUUUCGCUUCUGAGAUUCACCGGCCUCACACUACCAAAUAGGAG AAAGUAAUCUGUGCAUUUCUUUCGCGUCUGAGAUUCACCGGCCUCCCUGGGCAGAC AUUACCUGATT
‑3′
。
[0023]所述的增加外源性miR
‑
106a通过miR
‑
106a模拟物实现，采用的miR
‑
106amimic的序列如下：
[0024]5′‑
AAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG
‑3′
。
[0025]所述的抑制miR
‑
106a表达降低通过miR
‑
106a核酸抑制物实现，采用的miR
‑
106a inhibitor的序列如下：
[0026]5′‑
UAUGGCUUUUUAUUCCUAUGUGA
‑3′
。
[0027]本专利技术通过基因工程技术改变lncRNA CACF在人脐静脉内皮细胞中的表达量，确定其在调控人脐静脉内皮细胞自噬中的作用。
[0028]本专利技术通过比对lncRNA CACF与miRbase数据库中成熟miRNAs的序列，筛选出与lncRNA CACF(SEQ ID NO：1)存在序列匹配的miR
‑
106a(SEQ ID NO：2)，通过RNA pull down实验和双荧光素酶实验分别在细胞外和细胞内验证了两者之间的结合。
[0029]本专利技术通过基因工程技术改变miR
‑
106a在人脐静脉内皮细胞中的表达量，确定其在调控人脐静脉内皮细胞自噬中的应用。
[0030]本专利技术的验证结果如下：
[0031]1、本专利技术通过G本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.lncRNA CACF在制备人脐静脉内皮细胞自噬诱导剂中的应用，其特征在于：所述的lncRNA CACF如SEQ ID NO：1所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：增加外源性lncRNA CACF，人脐静脉内皮细胞自噬水平增加；抑制lncRNA CACF的表达，人脐静脉内皮细胞自噬水平降低。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的lncRNA CACF通过竞争性吸附miR
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106a，实现人脐静脉内皮细胞自噬水平调控。4.miR
‑
106a在制备人脐静脉内皮细胞自噬抑制剂中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：增加外源性miR
‑
106a，人脐静脉内皮细胞自噬水平降低；抑制miR
‑
106a表达，人脐静脉内皮细胞自噬水平上升。6.根据权利要求2、3、5...

【专利技术属性】
技术研发人员：王希龙，白国锋，张豪，廖伟莉，袁晓龙，潘金春，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：