靶向TRIM5α基因的sgRNA及食蟹猴TRIM5α基因敲除的方法技术

本发明专利技术涉及靶向TRIM5α基因的sgRNA及食蟹猴TRIM5α基因敲除的方法，属于生物技术领域。本发明专利技术提供的靶向敲除TRIM5α基因的sgRNA，其为TRIM5a

【技术实现步骤摘要】
靶向TRIM5
α
基因的sgRNA及食蟹猴TRIM5
α
基因敲除的方法


[0001]本专利技术属于生物
，涉及靶向TRIM5α基因的sgRNA及食蟹猴TRIM5α基因敲除的方法。

技术介绍

[0002]人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)是一种慢病毒属逆转录病毒，其1型病毒HIV
‑
1主要感染CD4+T细胞，是获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)的病因，它的特征是CD4+T细胞损伤、严重免疫缺陷和易致命。与人类对HIV
‑
1的易感性不同，大量研究表明HIV
‑
1在一些猕猴体内受到进入后感染阻断，这使得HIV
‑
1感染的非人灵长类动物模型的构建变的非常困难。研究人员希望通过基因敲除技术构建食蟹猴HIV
‑
1感染模型，为AIDS病预防和治疗策略的相关研究助力。
[0003]三重基序蛋白5alpha(Tripartite motif containing 5alpha，TRIM5α)在2004年，首次被确定可以抵御HIV
‑
1感染，并观察到恒河猴TRIM5α比人类TRIM5α更能有效地抑制HIV
‑
1感染。TRIM5α是一种逆转录病毒限制因子，介导病毒进入后的感染阻断。TRIM5α是TRIM5基因产生的剪接变异体之一，包含RING、Br/>‑
box2、Coiled
‑
coil和PRYSPRY三个结构域。RING结构域与E3泛素连接酶作用，通过泛素
‑
蛋白酶体依赖途径降解病毒；Coiled
‑
coil结构域介导TRIM5α单体的二聚化和高阶组装的形变，PRYSPRY结构域识别组装的病毒核心以介导限制，且PRYSPRY结构域和Colied
‑
coli结构域共同确定TRIM5a介导的逆转录病毒衣壳捕获的特异性。
[0004]由上可知敲除食蟹猴TRIM5α基因能降低食蟹猴对HIV
‑
1的限制作用，有可能为制造非人灵长类HIV
‑
1感染动物模型提供新的有效方法。

技术实现思路

[0005]为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种靶向敲除TRIM5α基因的sgRNA，其中TRIM5α基因来自食蟹猴。
[0006]本专利技术的另一目的在于提供一种食蟹猴TRIM5α基因敲除的方法，该方法为食蟹猴胚胎上的基因敲除方法，该基因敲除方法敲除食蟹猴TRIM5α基因，从而能降低食蟹猴对HIV
‑
1的限制作用，进而有可能为制造非人灵长类HIV
‑
1感染动物模型提供新的有效方法。
[0007]本专利技术通过设计、构建、筛选，最终提供靶向食蟹猴TRIM5α基因的两个高效sgRNA及其靶位点序列，提供一种既可能获得单一位点突变，也可能实现两条sgRNA位点之间大片段的食蟹猴TRIM5α基因敲除的方法，为建立非人灵长类艾滋病感染模型提供思路。
[0008]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种靶向敲除TRIM5α基因的sgRNA，所述sgRNA为TRIM5a
‑
sgRNA4
‑
4和TRIM5a
‑
sgRNA4
‑
5，其核苷酸序列如下所示：
[0009]TRIM5a
‑
sgRNA4
‑
4：5
’‑
GATCTGGAGCATCGGTTGCA(GGG)
‑3’
；
[0010]TRIM5a
‑
sgRNA4
‑
5：5
’‑
CTCAAAATCTGCCAAGACGT(TGG)
‑3’
。
[0011]其中，括号内为PAM位点NGG，sgRNA识别位点。
[0012]本专利技术提供所述的靶向敲除TRIM5α基因的sgRNA在TRIM5α基因敲除领域中的应用。
[0013]本专利技术还提供一种食蟹猴TRIM5α基因敲除的方法，包括如下步骤：体外合成本专利技术所述的靶向敲除TRIM5α基因的sgRNA，与Cas9 mRNA混合注射入食蟹猴胚胎，得到TRIM5α基因敲除的食蟹猴胚胎。
[0014]作为本专利技术所述的食蟹猴TRIM5α基因敲除的方法，其中的一种优选实施方式，所述体外合成靶向敲除TRIM5α基因的sgRNA的具体操作步骤如下：
[0015](1)根据权利要求1所述的靶向敲除TRIM5α基因的sgRNA，设计合成引物X，然后以px459载体为模板进行PCR扩增，得到转录DNA模板；
[0016](2)将步骤(1)制得的转录DNA模板进行体外转录，得到所述sgRNA。
[0017]优选的，所述的引物X的核苷酸序列如下所示：
[0018]TRIM5α
‑
sgRNA4
‑4‑
Fp：TAATACGACTCACTATAGGATCTGGAGCATCGGTTGCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；
[0019]TRIM5α
‑
sgRNA4
‑4‑
Rp：AGCACCGACTCGGTGCCACTT；
[0020]TRIM5α
‑
sgRNA4
‑5‑
Fp：
[0021]TAATACGACTCACTATAGCTCAAAATCTGCCAAGACGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；
[0022]TRIM5α
‑
sgRNA4
‑5‑
Rp：AGCACCGACTCGGTGCCACTT。
[0023]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0024](1)本专利技术针对食蟹猴TRIM5α基因提供了1个高效的敲除靶点。
[0025](2)本专利技术经敲除效果检测鉴定，能有效在食蟹猴胚胎上实现TRIM5α基因的敲除，为建立非人灵长类艾滋病动物模型奠定了坚实基础。
附图说明
[0026]图1是sgRNA体外靶位点活性检测酶切结果图；
[0027]图2是突变型胚胎测序峰图。
具体实施方式
[0028]为更好地说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合具体附图和实施例对本专利技术作进一步说明。实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0029]实施例1靶向食蟹猴TRIM5α基因的sgRNA合成及体外活性检测
[0030]1、靶向食蟹猴TRIM5α基因的sgRNA的设计
[0031]针对食蟹猴TRIM5α基因(基因ID为NC_052268.1)，在食本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向敲除TRIM5α基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA为TRIM5a
‑
sgRNA4
‑
4和TRIM5a
‑
sgRNA4
‑
5，其核苷酸序列如下所示：TRIM5a
‑
sgRNA4
‑
4：5
’‑
GATCTGGAGCATCGGTTGCA(GGG)
‑3’
；TRIM5a
‑
sgRNA4
‑
5：5
’‑
CTCAAAATCTGCCAAGACGT(TGG)
‑3’
。2.一种sgRNA的应用，其特征在于，所述sgRNA为权利要求1所述的靶向敲除TRIM5α基因的sgRNA，所述应用为所述sgRNA在TRIM5α基因敲除领域中的应用。3.一种食蟹猴TRIM5α基因敲除的方法，其特征在于，包括如下步骤：体外合成权利要求1所述的靶向敲除TRIM5α基因的sgRNA，与Cas9 mRNA混合注射入食蟹猴胚胎，得到TRIM5α基因敲除的食蟹猴胚胎。4.如权利要求3所述的食蟹猴TRIM5α基因敲除的...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨世华，徐雅雯，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：