LncRNAIFA及其在猪卵巢颗粒细胞中的应用制造技术

本发明专利技术公开了lncRNA IFA及其在猪卵巢颗粒细胞中的应用。本发明专利技术通过预测lncRNA IFA的开放阅读框，以及通过构建验证lncRNA IFA编码蛋白质的载体检测其蛋白编码能力，并在超表达和干扰lncRNA IFA后检测了猪卵巢颗粒细胞的增殖、凋亡比率、细胞活性以及细胞周期进程，发现lncRNA IFA可以促进卵巢颗粒细胞增殖、抑制凋亡、提高卵巢颗粒细胞活性，并加快颗粒细胞的细胞周期进程，为卵巢颗粒细胞的增殖凋亡调控机制研究积累了材料。控机制研究积累了材料。控机制研究积累了材料。

【技术实现步骤摘要】
LncRNA IFA及其在猪卵巢颗粒细胞中的应用


[0001]本专利技术属于细胞工程和基因工程
，具体涉及lncRNA IFA及其在猪卵巢颗粒细胞中的应用。

技术介绍

[0002]LncRNA通常指长度超过200个核苷酸连接的内源性细胞RNA分子，根据lncRNA的基因位点解剖学特性可将其分为正义lncRNA(Sense lncRNA)、反义LncRNA(Antisense lncRNA)、内含子lncRNA(Intronic lncRNA)、双向lncRNA(Divergent lncRNA)及基因间lncRNA(Intergenic lncRNA)五类。
[0003]根据现有研究资料，lncRNA的作用模式主要分为以下四种：
[0004]1.信号(Signal)：lncRNA具有直接调控下游基因转录的作用，可以作为信号传导分子参与特殊信号通路的传导。
[0005]2.诱饵(Decoys)：lncRNA可以作为分子阻断剂，与DNA结合蛋白结合，进而阻断该蛋白分子的作用；抑或通过ceRNA机制，充当microRNA的分子海绵，阻断microRNA对下游靶标mRNA的抑制作用。
[0006]3.支架(Scaffold)：lncRNA作为媒介，同时结合多个蛋白分子从而形成蛋白
‑
lncRNA复合物，实现不同信号通路之间的信息整合与交流。
[0007]4.引导(Guide)：lncRNA和蛋白分子结合(例如转录因子)，并将其引导至特定的DNA序列上，促进该蛋白发挥效应。
[0008]目前，已有大量的研究表明，lncRNA可以通过不同的作用模式参与细胞增殖、凋亡、迁移及分化的调控。
[0009]卵母细胞、颗粒细胞和膜细胞组成了卵泡的主要结构。在卵泡的发育过程中，卵泡发育最为显著的形态变化特征为颗粒细胞的增殖和卵泡腔的形成。原始卵泡时期，卵母细胞被单层扁平状的颗粒细胞所包裹，随着卵泡的发育，颗粒细胞逐渐增殖至数层，形态由扁平状变为柱状，并在卵泡成熟排卵前形成包裹卵母细胞的卵丘颗粒细胞和紧贴卵泡内壁的壁层颗粒细胞。此外，大量的研究普遍认为，卵泡的发育、排卵过程和颗粒细胞的增殖分化有着密切联系，而颗粒细胞的过度凋亡会引起卵泡闭锁。

技术实现思路

[0010]为解决相关问题，本专利技术的首要目的在于提供一种长链非编码RNA。
[0011]本专利技术的另一目的在于提供上述长链非编码RNA在猪卵巢颗粒细胞中的应用。
[0012]为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0013]一种长链非编码RNA，命名为lncRNA IFA，其核苷酸序列如SEQID NO：1所示。
[0014]上述长链非编码RNA相关的生物材料，为下述生物材料中的任意一种或多种组合：
[0015]1)编码所述长链非编码RNA的DNA分子；
[0016]2)含有1)中所述DNA分子的表达盒；
[0017]3)含有1)中所述DNA分子的重组载体，或含有2)中所述表达盒的重组载体；
[0018]4)抑制所述长链非编码RNA表达的小干扰RNA片段；
[0019]5)含有1)中所述DNA分子的重组细胞，或含有2)中所述表达盒的重组细胞，或含有3)所述重组载体的重组细胞，或含有4)中所述小干扰RNA片段的重组细胞。
[0020]进一步地，1)中所述DNA分子通过如下方式制备得到：提取猪卵巢颗粒细胞的RNA，将其逆转录成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，得到目的片段。
[0021]更进一步地，PCR扩增所用引物如下所示：
[0022]lncRNA IFA F：5
’‑
GGCGATGCCTGGGTACATGG
‑3’
；
[0023]lncRNA IFA R：5
’‑
GAGACCGCGTCCACTCCGCC
‑3’
。
[0024]进一步地，3)中所述重组载体通过如下方式制备得到：将所述DNA分子连接到用限制性内切酶BamHI和Xba I酶切后的pcDNA3.1载体上，得到重组载体。
[0025]进一步地，4)中所述小干扰RNA片段的靶向序列为：5
’‑
TGACCTGGGCGACGTAGCA
‑3’
。
[0026]上述长链非编码RNA或上述长链非编码RNA相关的生物材料在猪卵巢颗粒细胞中的应用，体外环境下，所述的长链非编码RNA正调控细胞增殖、细胞凋亡、细胞活性、细胞周期进程中的任意一种或多种功能表型。
[0027]进一步地，增加外源性lncRNA IFA，促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、提高细胞活性和/或加快细胞周期进程；抑制lncRNA IFA表达，抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、降低细胞活性和/或阻滞细胞周期进程中。
[0028]上述长链非编码RNA或DNA分子或表达盒或重组载体在制备药物中的应用，所述的药物为下述药物中的任意一种或多种组合：
[0029]Ⅰ.促进猪卵巢颗粒细胞增殖的药物；
[0030]Ⅱ.抑制猪卵巢颗粒细胞凋亡的药物；
[0031]Ⅲ.提高猪卵巢颗粒细胞活性的药物；
[0032]Ⅳ.加快猪卵巢颗粒细胞的细胞周期进程的药物；
[0033]Ⅴ
.促进卵泡发育的药物。
[0034]LncRNA IFA(Inhibitor of Follicular Atresia，暂命名)为针对猪卵巢颗粒细胞进行RNA
‑
seq所获得的lncRNA，其核苷酸序列如SEQID NO：1所示，其在卵巢颗粒细胞的增殖、凋亡、调控过程中可能发挥重要作用。
[0035]本专利技术通过基因工程和细胞工程技术，首先明确lncRNA IFA的全部序列及lncRNA IFA是否具有编码蛋白的能力，进而确定lncRNA IFA在卵巢颗粒细胞增殖与凋亡调控中的应用。
[0036]本专利技术的验证结果如下：
[0037]1、本专利技术通过5
’
/3
’
RACE实验获取lncRNA IFA的全长序列(图1中a)；生物信息学网站(CPC 2.0)预测结果显示lncRNA IFA不具有蛋白编码能力(图1中b)；通过NCBI网站的ORF finder工具对lncRNA IFA序列进行分析，发现其序列中存在3个ORF(图1中c)。
[0038]2、本专利技术通过质粒转染及荧光成像检测到，转染pcDNA3.1
‑
EGFP质粒的颗粒细胞中可以检测到绿色荧光，而转染pcDNA3.1、pcDNA3.1
‑
Mut EGFP及pcDNA3.1
‑
ORF+Mut EGFP质粒的颗粒细胞无法检测到绿色荧光(图2中b)。
[0039]3、本专利技术通过EdU(5
‑
Ethynyl
‑
2'
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种长链非编码RNA，其特征在于：命名为lncRNA IFA，其核苷酸序列如SEQID NO：1所示。2.权利要求1中所述长链非编码RNA相关的生物材料，其特征在于：为下述生物材料中的任意一种或多种组合：1)编码所述长链非编码RNA的DNA分子；2)含有1)中所述DNA分子的表达盒；3)含有1)中所述DNA分子的重组载体，或含有2)中所述表达盒的重组载体；4)抑制所述长链非编码RNA表达的小干扰RNA片段；5)含有1)中所述DNA分子的重组细胞，或含有2)中所述表达盒的重组细胞，或含有3)所述重组载体的重组细胞，或含有4)中所述小干扰RNA片段的重组细胞。3.根据权利要求2所述的长链非编码RNA相关的生物材料，其特征在于：1)中所述DNA分子通过如下方式制备得到：提取猪卵巢颗粒细胞的RNA，将其逆转录成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，得到目的片段；PCR扩增所用引物如下所示：lncRNA IFA F：5
’‑
GGCGATGCCTGGGTACATGG
‑3’
；lncRNA IFA R：5
’‑
GAGACCGCGTCCACTCCGCC
‑3’
。4.根据权利要求2所述的长链非编码RNA相关的生物材料，其特征在于：3)中所述重组载体通过如下方式制备得到：将所述DNA分子连接到用限...

【专利技术属性】
技术研发人员：李加琪，张哲，李念，李硕，胡梦婷，郭懿萱，袁晓龙，张豪，陈赞谋，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：