本发明专利技术公开了一种纳米化壳聚糖/dsGRK复合体及其制备方法和应用，所述纳米化壳聚糖/dsGRK复合体包括dsGRK和壳聚糖，所述壳聚糖的去乙酰化程度为75％。本发明专利技术提供的绿盲蝽纳米化壳聚糖/dsGRK复合体可有效提高dsGRK的稳定性，而且制备工艺简单，且对环境无污染。纳米化壳聚糖/dsGRK复合体处理组中的绿盲蝽死亡率显著提高，效果良好。效果良好。效果良好。
【技术实现步骤摘要】
一种纳米化壳聚糖/dsGRK复合体及其制备方法和应用
[0001]本专利技术属于农业基因工程
，具体涉及一种纳米化壳聚糖/dsGRK复合体及其制备方法和在绿盲蝽防治中的应用。
技术介绍
[0002]绿盲蝽Apolygus lucorum(Hemiptera:Miridae)属半翅目盲蝽科，是果树、蔬菜等多种经济作物上的重要害虫。绿盲蝽的防治主要依赖化学农药防治，但长期使用化学药剂会带来3R效应。近年来，双链RNA(dsRNA)介导的RNA干扰(RNAi)技术，已广泛应用于昆虫基因的功能研究，并在害虫防治方面显示出巨大的应用潜力。常用的RNAi方法包括注射﹑浸泡以及饲喂等。其中，由于成本高，对操作技术要求较高，因此注射法仅适用于实验室研究，不能实现在田间的推广应用。此外，由于dsRNA在外界环境中及不稳定，因此采用浸泡或饲喂法，RNAi效果较低。
[0003]近年来，与传统的dsRNA递送系统相比，通过纳米材料介导的dsRNA传递系统在提高RNAi效率方面显示出了巨大优势。纳米材料主要通过静电、范德华力、氢键等相互作用与核酸的磷酸基团结合，形成dsRNA/纳米材料复合物，可提升其稳定性。壳聚糖(Chitosan，CS)又称脱乙酰甲壳素，是由广泛存在于自然界的几丁质(chitin)经化学处理脱乙酰作用得到。壳聚糖含有羟基和氨基，是最常用的聚合物之一。由于其具有成本低、易降解、生物相容性好等优点，可成为dsRNA、siRNA、质粒DNA、寡核苷酸、肽甚至蛋白质的一种有前途的递送系统。壳聚糖在微酸性条件下带正电荷，有助于与带负电荷的核酸通过静电作用形成dsRNA/纳米复合物。
[0004]目前，已有研究表明，壳聚糖与dsRNA形成的纳米复合物可以稳定和有效的递送进入植物或昆虫中，但是RNAi纳米制剂在绿盲蝽防治中的研究仍是空白。
技术实现思路
[0005]专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是通过体外合成绿盲蝽GRK基因dsRNA，与壳聚糖形成纳米制剂即纳米化壳聚糖/dsGRK复合体，提高dsRNA的稳定性，有效的增强RNA干扰效率，以进一步提升防治绿盲蝽的效果。
[0006]本专利技术还要解决的技术问题是提供了纳米化壳聚糖/dsGRK复合体的制备方法。
[0007]本专利技术最后要解决的技术问题是提供了所述纳米化壳聚糖/dsGRK复合体在防治绿盲蝽中的应用。
[0008]技术方案：为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种纳米化壳聚糖/dsGRK复合体，所述纳米化壳聚糖/dsGRK复合体包括dsGRK和壳聚糖，所述壳聚糖的去乙酰化程度为75～80％。其中，所述dsGRK为绿盲蝽G蛋白偶联受体激酶(GRK)的dsRNA，其dsRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]其中，所述dsGRK和壳聚糖的质量比为1：2～5。
[0010]其中，所述纳米化壳聚糖/dsGRK复合体尺寸为200～400nm，表面电荷为16.9
±
4.24mV。
[0011]本
技术实现思路
还包括所述的纳米化壳聚糖/dsGRK复合体的制备方法，包括以下步骤：1)将去乙酰化程度为75～80％的壳聚糖溶解在醋酸钠溶液中制备壳聚糖溶液；
[0012]2)向体外合成的dsGRK中加入硫酸钠溶液制备dsGRK悬浮液；
[0013]3)将壳聚糖溶液和dsGRK悬浮液混合，水浴静置后高速离心即得。
[0014]其中，步骤1)中，所述壳聚糖溶液中的壳聚糖浓度为0.02～0.1w/v％；步骤2)中，所述硫酸纳溶液的浓度为50～100mmol/L。
[0015]其中，步骤2)中，所述dsGRK与硫酸钠的质量比为1:10～20。
[0016]其中，在步骤2)中，所述硫酸钠溶液的浓度为50～100mmol/L；优选的浓度为100mmol/L。
[0017]其中，步骤3)水浴静置步骤中，水浴温度为50～60℃，静置1～2min；步骤3)高速离心步骤中，离心条件12000～15000rpm，1～2min。
[0018]本
技术实现思路
还包括所述的纳米化壳聚糖/dsGRK复合体在绿盲蝽防治中的应用。
[0019]其中，所述应用为：将纳米化壳聚糖/dsGRK复合体喷施在植物表面上，喂食所述的绿盲蝽。
[0020]其中，所述植物包括但不仅限于四季豆。
[0021]有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
[0022](1)本专利技术提供了一种绿盲蝽纳米化壳聚糖/dsGRK复合体，纳米材料为75％去乙酰化的壳聚糖；dsGRK的靶标基因为绿盲蝽G蛋白偶联受体激酶基因；采用体外合成dsGRK，利用纳米材料壳聚糖，可有效提高dsGRK的稳定性。
[0023](2)本专利技术提供了一种绿盲蝽纳米化壳聚糖/dsGRK复合体的制备方法，工艺简单，且对环境无污染。
[0024](3)本专利技术提供了一种纳米化壳聚糖/dsGRK复合体在绿盲蝽防治中的应用，纳米化壳聚糖/dsGRK复合体处理组中的绿盲蝽死亡率显著提高，效果良好。
附图说明
[0025]图1为体外合成dsGRK的电泳图。
[0026]图2为纳米化壳聚糖/dsGRK复合体最佳负载比例电泳图。图中，M：maker；泳道1：裸露的dsGRK；泳道2：壳聚糖溶液；泳道3：dsGRK
‑
壳聚糖质量比为5：1；泳道4：dsGRK
‑
壳聚糖质量比为4：1；泳道5：dsGRK
‑
壳聚糖质量比为3：1；泳道6：dsGRK
‑
壳聚糖质量比为2：1；泳道7：dsGRK
‑
壳聚糖质量比为1：1；泳道8：dsGRK
‑
壳聚糖质量比为1：2；泳道9：dsGRK
‑
壳聚糖质量比为1：3；泳道10：dsGRK
‑
壳聚糖质量比为1：4；泳道11：dsGRK
‑
壳聚糖质量比为1：5。
[0027]图3为纳米化壳聚糖/dsGRK复合体的平均粒径(Z
‑
average)和表面电荷(Zeta电位)。
[0028]图4为纳米化壳聚糖/dsGRK复合体的透射电镜图像。
[0029]图5为检测纳米化壳聚糖/dsGRK复合体稳定性的电泳图。图中，M：maker；泳道1：未经过RNase A处理的dsGRK；泳道2：未经过RNase A处理的CS
‑
dsGRK；泳道3：经过RNase A处理的dsGRK；泳道4：经过RNase A处理的CS
‑
dsGRK。
[0030]图6为qPCR检测GRK的相对表达量，即RNAi的沉默效率。
[0031]图7为不同处理组下绿盲蝽的存活率。
具体实施方式
[0032]下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种纳米化壳聚糖/dsGRK复合体，其特征在于，所述纳米化壳聚糖/dsGRK复合体包括dsGRK和壳聚糖，所述壳聚糖的去乙酰化程度为75～80％，所述dsGRK为绿盲蝽G蛋白偶联受体激酶的dsRNA，其dsRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的纳米化壳聚糖/dsGRK复合体，其特征在于，所述dsGRK和壳聚糖的质量比为1：2～5。3.根据权利要求1所述的纳米化壳聚糖/dsGRK复合体，其特征在于，所述纳米化壳聚糖/dsGRK复合体尺寸为200～400nm，表面电荷为16.9
±
4.24mV。4.权利要求1～3任一项所述的纳米化壳聚糖/dsGRK复合体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将去乙酰化程度为75～80％的壳聚糖溶解在醋酸钠溶液中制备壳聚糖溶液；2)向体外合成的dsGRK中加入硫酸钠溶液制备dsGRK悬浮液；3)将壳聚糖溶液和dsGRK悬浮液混合，水浴静置后高速离...
【专利技术属性】
技术研发人员：谭永安，乔恒，王小峰，胡珍娣，肖留斌，赵静，
申请(专利权)人：南京善思生态科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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