具有杀伤开关的供体T细胞制造技术

所公开的方法一般涉及预防、治疗、遏制、控制或以其它方式减轻T细胞疗法的副作用，该T细胞疗法被设计成加速免疫重建、诱导移植物抗恶性肿瘤效应、和/或靶向肿瘤细胞。在一些实施方案中，本公开提供了包括适于敲除HPRT的组分的递送媒介物。在一些实施方案中，递送媒介物包括gRNA分子和内切核酸酶，例如Cas蛋白。在一些实施方案中，gRNA分子靶向HPRT 1基因的外显子2、3、或8内的位置。或8内的位置。或8内的位置。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有杀伤开关的供体T细胞
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2020年6月26日提交的美国临时专利申请No.63/044,697的申请日的权益，其公开内容据此全文以引用方式并入本文。


[0003]本公开一般涉及基因疗法，特别是造血干细胞和/或淋巴细胞，如用表达载体转导的T细胞。本公开还涉及如通过CRISPR
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Cas系统的基因编辑。

技术介绍

[0004]异基因造血干细胞移植(allo
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HSCT)是血液恶性肿瘤和血细胞遗传性障碍(如镰状细胞病)的治愈性疗法。与allo
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HSCT相关联的挑战包括鉴定适当的供体细胞来源。尽管相合血缘供体(MRD)和相合无血缘供体(MUD)提供了相关风险较低的HSC来源，但与几乎每个人都有直系供体(通常是父母或同胞)的单倍体相同的供体的可用性相比，这些供体的可用性显著降低。然而，对于allo
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HSCT，存在着与使用单倍体相同的供体相关联的并发症，最显著的是有可能发展出移植物抗宿主病(GvHD)，这仍然是成功的allo
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HSCT的障碍。据信经历allo
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HSCT的患者中约有一半发展出GvHD而需要治疗，并且超过10％的患者可能因其死亡。GvHD呈现为涉及包括胃肠道、皮肤、粘膜、肝和肺在内的多个器官系统的异质症状。免疫抑制药物充当着预防和减少GvHD的核心策略。目前，采用皮质类固醇对GvHD的皮质类固醇标准治疗取得的成功非常有限，因为许多患者发展出类固醇抵抗型疾病。关于在急性和慢性GvHD的治疗中哪些构成了最佳二线和三线方法尚无明确的共识(参见Jamil,M.O.&Mineishi,S.Int J Hematol(2015)101:452)。
[0005]为了降低GvHD发展的风险，单倍体相同的移植物通常是T细胞衰竭的。然而，供体T细胞的缺乏使移植受者免疫受损，并且可导致移植患者的致死感染率提高。此外，最近的工作显示，除了在CD4+和CD8+T细胞植入所需的延长时间段内提供T细胞免疫(多至2年)以外，供体T细胞的存在还显著改善供体细胞植入，从而减少对重复HSCT的潜在需求。
[0006]在allo
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HSCT恶性环境中，由供体T细胞的存在提供的益处包括抗肿瘤活性、或移植物抗肿瘤(GVT)效应(也称为移植物抗白血病
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GVL)。在1990年，首次报道了在患有慢性髓性白血病(CML)的患者中的供体淋巴细胞输注(DLI)导致在HSCT后复发后的疾病缓解。在DLI之前，HSCT后复发的患者很可能死于其疾病，而少数患者将接受第二次移植。在CML中成功后，DLI随后用于其它血液恶性肿瘤，如急性白血病和骨髓瘤。因此，一项重大的挑战涉及GVT效应的适当平衡，该效应既负责实现持续缓解，但也负责与GvHD相关联的毒性。

技术实现思路

[0007]修饰人类干细胞的基因疗法策略为治愈许多人类疾病带来广阔的前景。据信直到开发出使GvHD最小化且同时维持供体T细胞的积极贡献的方法，才能实现allo
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HSCT的全部治疗潜能。
[0008]本公开的第一方面是一种在向对其有治疗需要的患者提供淋巴细胞输注益处的同时减轻副作用的方法，该方法包括：(a)通过用(i)内切核酸酶和(ii)靶向HPRT 1基因的外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子转染或转导从供体样本获得的淋巴细胞，生成基本HPRT缺陷型淋巴细胞群；(b)离体正选择基本HPRT缺陷型淋巴细胞群，以提供经修饰淋巴细胞群；以及(c)向患者施用治疗有效量的经修饰淋巴细胞群。在一些实施方案中，淋巴细胞是T细胞，优选地人原代T细胞。在一些实施方案中，该方法还包括向患者施用HSC移植物。在一些实施方案中，HSC移植物在施用经修饰淋巴细胞群之前、同时、或之后施用。
[0009]在一些实施方案中，指导RNA分子靶向HPRT1基因的外显子3内的序列。在一些实施方案中，指导RNA分子靶向HPRT1基因的外显子8内的序列。在一些实施方案中，靶向HPRT1基因的外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子与SEQ ID NO:40
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44和46
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56中的任一者具有至少90％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT1基因的外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子与SEQ ID NO:40
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56中的任一者具有至少91％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT1基因的外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子与SEQ ID NO:40
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56中的任一者具有至少92％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT1基因的外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子与SEQ ID NO:40
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56中的任一者具有至少93％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT1基因的外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子与SEQ ID NO:40
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56中的任一者具有至少94％序列同一性。
[0010]在一些实施方案中，靶向HPRT1基因的外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子与SEQ ID NO:40
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56中的任一者具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT1基因的外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子与SEQ ID NO:40
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56中的任一者具有至少96％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT1基因的外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子与SEQ ID NO:40
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56中的任一者具有至少97％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT1基因的外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子与SEQ ID NO:40
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56中的任一者具有至少98％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT1基因的外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子与SEQ ID NO:40
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56中的任一者具有至少99％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT1基因的外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子包含SEQ ID NO:40
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56中的任一者。
[0011]在一些实施方案中，内切核酸酶包含Cas蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Cas9蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Cas12蛋白。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12a蛋白。在一些实施方案本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种在向对其有治疗需要的患者提供淋巴细胞输注益处的同时减轻副作用的方法，其包括：(a)通过用(i)内切核酸酶和(ii)靶向HPRT 1基因的外显子2、外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子转染或转导从供体样本获得的淋巴细胞，生成基本HPRT缺陷型淋巴细胞群；(b)离体正选择所述基本HPRT缺陷型淋巴细胞群，以提供经修饰淋巴细胞群；以及(c)向所述患者施用治疗有效量的所述经修饰淋巴细胞群。2.根据权利要求1所述的方法，其还包括向所述患者施用HSC移植物。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述HSC移植物在施用所述经修饰淋巴细胞群之前、同时、或之后施用。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述指导RNA分子靶向HPRT 1基因的外显子2内的序列。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述指导RNA分子靶向HPRT 1基因的外显子3内的序列。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述指导RNA分子靶向HPRT 1基因的外显子8内的序列。7.根据权利要求1所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子2的所述指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57
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61中的任一者具有至少95％序列同一性。8.根据权利要求1所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子2的所述指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57
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61中的任一者具有至少99％序列同一性。9.根据权利要求1所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子2的所述指导RNA分子包含SEQ ID NO:45和57
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61中的任一者。10.根据权利要求1所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子3之一内的序列的所述指导RNA分子与SEQ ID NO:41
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51中的任一者具有至少95％序列同一性。11.根据权利要求1所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子3之一内的序列的所述指导RNA分子与SEQ ID NO:41
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44、46和50
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51中的任一者具有至少99％序列同一性。12.根据权利要求1所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子3之一内的序列的所述指导RNA分子包含SEQ ID NO:41
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51中的任一者。13.根据权利要求1所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子8之一内的序列的所述指导RNA分子与SEQ ID NO:47
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49、46、55和56中的任一者具有至少95％序列同一性。14.根据权利要求1所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子8之一内的序列的所述指导RNA分子与SEQ ID NO:47
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49、46、55和56中的任一者具有至少99％序列同一性。15.根据权利要求1所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子8之一内的序列的所述指导RNA分子包含SEQ ID NO:47
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49、46、55和56中的任一者。16.根据权利要求1所述的方法，其中所述指导RNA分子与位于基于基因组构建物GRCh38的约134475181至约134475364之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列至少约85％互补。17.根据权利要求1所述的方法，其中所述指导RNA分子靶向位于基于基因组构建物GRCh38的约134475181至约134475364之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置
的染色体X内的序列。18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述内切核酸酶包含Cas蛋白。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述Cas蛋白包含Cas9蛋白。20.根据权利要求18所述的方法，其中所述Cas蛋白包含Cas12蛋白。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述Cas12蛋白是Cas12a蛋白。22.根据权利要求20所述的方法，其中所述Cas12蛋白是Cas12b蛋白。23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中用病毒递送媒介物、非病毒递送媒介物或者通过物理方法来转染或转导从所述供体样本获得的淋巴细胞。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述物理方法选自显微注射和电穿孔。25.根据权利要求23所述的方法，其中所述非病毒递送媒介物是纳米胶囊，任选地其中所述纳米胶囊包含至少一个靶向部分。26.根据权利要求23所述的方法，其中所述病毒递送媒介物是表达载体，并且其中所述表达载体包括编码所述内切核酸酶的第一核酸序列以及编码所述指导RNA分子的第二核酸。27.根据权利要求26所述的方法，其中所述表达载体是慢病毒表达载体。28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中与未转染的供体淋巴细胞相比，所述基本HPRT缺陷型淋巴细胞群内的HPRT1基因表达水平降低至少约70％，优选地降低至少约80％，更优选地降低至少约90％。29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述正选择包括使所述生成的基本HPRT缺陷型淋巴细胞群与嘌呤类似物接触，优选地其中所述嘌呤类似物选自6
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TG和6
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MP。30.根据权利要求29所述的方法，其中所述嘌呤类似物的量在约1至约15μg/mL的范围内。31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：CG，
申请(专利权)人：美国杰特贝林生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：