用于递送细胞调节剂的纳米胶囊制造技术

本发明专利技术涉及包含核糖核蛋白复合物的聚合物纳米胶囊及其递送方法。在一些实施方案中，聚合物纳米胶囊包含聚合物壳和核糖核蛋白复合物，其中聚合物壳包含至少一种带正电的单体、至少一种中性单体和交联剂。还公开聚合物纳米胶囊与一个或多个靶向部分和/或一个或多个稳定化部分的缀合物。个稳定化部分的缀合物。个稳定化部分的缀合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于递送细胞调节剂的纳米胶囊
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本专利技术要求2018年12月23日提交的美国临时申请第62/784,503号的申请日的权益，该申请的公开内容整体援引加入本文。


[0003]本专利技术总体涉及基因治疗。更具体来说，本专利技术涉及包含核糖核蛋白复合物的纳米胶囊及其在基因治疗的应用。特别地，本专利技术涉及包含核糖核蛋白复合物的纳米胶囊，其在体内和/或体外的应用，包括在造血干细胞中的应用。

技术介绍

[0004]能够精确修饰活细胞内DNA序列的技术对基础和应用研究都很有价值。成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR)是Ishino在大肠杆菌中首次发现的原核生物免疫系统(Ishino,et al.,Journal of Bacteriology 169(12):5429
‑
5433(1987)。这些系统通过以序列特异性方式靶向病毒和质粒的核酸，在细菌和古细菌中提供针对病毒和质粒的免疫力。
[0005]据认为，提供上述免疫力涉及两个主要阶段，即获取阶段和干扰阶段。获取阶段涉及切割入侵病毒和质粒的基因组，并将其片段整合到细菌和古细菌的CRISPR基因座中。整合到基因组中的片段称为原间隔子，有助于保护生物体免受同一病毒或质粒的后续攻击。干扰阶段包括攻击入侵的病毒或质粒。据认为，这一特殊阶段依赖于整合序列(称为间隔子)转录成RNA，随后经过一些处理，RNA然后与入侵的多核苷酸(如病毒或质粒)的DNA或RNA中的互补序列杂交，同时还与能有效结合和/或切割DNA或RNA的蛋白或蛋白复合物缔合。
[0006]有几种不同的CRISPR
‑
Cas系统。在2类II型系统中，有两股RNA是CRISPR
‑
Cas系统的一部分：CRISPR RNA(crRNA)和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)。TracrRNA与pre
‑
crRNA的互补区域杂交，促进pre
‑
crRNA在RNase III酶的作用下成熟为crRNA。由tracrRNA和crRNA形成的双链被蛋白识别并与之缔合，例如Cas9，Cas9通过crRNA的序列引导到靶核酸，所述序列与靶核酸中的序列互补并缔合。据认为，这些基于RNA的免疫系统的最小组成部分可以通过使用单一的蛋白和两个RNA引导多核苷酸或单一的RNA分子，以位点特异性的方式重新编码以靶向DNA。
[0007]在2类V型CRISPR系统中，据认为，Cas蛋白Cpf1可以通过单一的crRNA序列以位点特异性的方式重新编码以靶向DNA。
[0008]总之，细菌Cas9核酸酶的表达，以及含有基因组靶向信息(例如，20bp序列)的短段RNA和与Cas9本身相关的结构成分，允许在目标基因组内所需位置处精确布置双链或单链断裂(DSB或SSB)。CRISPR
‑
Cas系统被认为优于其他基因组编辑方法，如核酸内切酶、巨核酸酶、锌指核酸酶和转录激活因子样效应核酸酶(TALENs)，这些可能需要为每个新的靶向基因座从头进行蛋白工程。
[0009]基因编辑技术，如CRISPR/Cas9系统，已显示出在各种细胞系以及生殖系基因组编
辑中效果良好(参见Doudna et al.,Genome editing,The new frontier of genome engineering with CRISPR
‑
Cas9,Science 346(6213):1258096)。慢病毒载体相当灵活，允许靶向基因组位点，并且其在筛选CRISPR系统的向导RNA(gRNA)方面显示出巨大的潜力，但Cas9的整合已显示出具有有限的潜在治疗用途(Hsu et al.,Development and applications of CRISPR
‑
Cas9 for genome engineering.Cell 157(6):1262
‑
1278)。
[0010]由于其低免疫原性和宽泛的趋性，一些小组已经开发了用于体内基因编辑的腺相关病毒载体(AAV)。然而，包装容量和需要非常高的滴度来递送至原代细胞是主要的问题(参见Ran et al.,"In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9,"Nature.2015Apr 9；520(7546)；186
‑
91；Swiech et al.,"In vivo interrogation of gene function in the mammalian brain using CRISPR
‑
Cas9,"Nat Biotechnol.2015Jan；33(1):102
‑
6；和Cong et al.,"Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems,"Science,2013Feb 15；339(6121):819
‑
23)。
[0011]Cas9和单向导RNA(sgRNA)的质粒递送已显示出在其他类型的细胞中是有效的，但在人初级T细胞和造血干细胞中只切除1
‑
5％的靶向蛋白表达(参见Mandal et al.,"Efficient ablation of genes in human hematopoietic stem and effector cells using CRISPR/Cas9,"Stem Cell 15(5):643
–
652)。Cas9核糖核酸蛋白的电穿孔在T细胞和干细胞中表现出高效和特异的基因组编辑，但将电穿孔应用于体内研究存在技术障碍(参见Schumann et al.,"Generation of knock
‑
in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins,"Proc Natl Acad Sci,2015Aug 18；112(33):10437
‑
42)。因此，到目前为止，基因编辑因子的体内递送仍是挑战。

技术实现思路

[0012]本专利技术的第一方面是一种聚合物纳米胶囊，其包含聚合物壳和核糖核蛋白复合物，其中聚合物壳包含至少一种带正电的单体、至少一种中性单体和交联剂。在一些实施方案中，聚合物壳包含至少两种带正电的单体。在一些实施方案中，核糖核蛋白复合物包含核酸内切酶和向导RNA。在一些实施方案中，核酸内切酶是Cas蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白选自Cas9、Cas12a和Cas12b。
[0013]在一些实施方案中，向导RNA靶向HPRT基因座。在一些实施方案中，靶向HPRT的向导RNA包含与SEQ ID NO:2具有至少90％相同性的核酸序列。在一些实施方案中，靶向HPRT的向导RNA包含与SE本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种聚合物纳米胶囊，其包含聚合物壳和核糖核蛋白复合物，其中所述聚合物壳包含至少一种带正电的单体、至少一种中性单体和交联剂。2.权利要求1的聚合物纳米胶囊，其中所述核糖核蛋白复合物包含核酸内切酶和向导RNA。3.权利要求2的聚合物，其中所述核酸内切酶是Cas蛋白。4.权利要求3的聚合物，其中所述Cas蛋白是2类Cas蛋白。5.权利要求4的聚合物，其中所述2类Cas蛋白是II型或V型Cas蛋白。6.权利要求3
‑
5中任一项的聚合物纳米胶囊，其中所述Cas蛋白选自Cas9和Cas12a。7.权利要求2
‑
6中任一项的聚合物纳米胶囊，其中所述向导RNA靶向HPRT基因座。8.权利要求7的聚合物纳米胶囊，其中所述靶向HPRT基因座的向导RNA包含与SEQ ID NO:2具有至少90％相同性的核酸序列。9.权利要求2
‑
6中任一项的聚合物纳米胶囊，其中所述向导RNA靶向β珠蛋白基因座。10.权利要求9的聚合物纳米胶囊，其中所述靶向β珠蛋白基因座的向导RNA包含与SEQ ID NO:3具有至少90％相同性的核酸序列。11.权利要求2
‑
6中任一项的聚合物纳米胶囊，其中所述向导RNA靶向CCR5基因座。12.权利要求11的聚合物纳米胶囊，其中所述靶向CCR5基因座的向导RNA包含与SEQ ID NO:1具有至少90％相同性的核酸序列。13.前述权利要求中任一项的聚合物纳米胶囊，其进一步包含至少一个靶向部分。14.权利要求13的聚合物纳米胶囊，其中所述聚合物纳米胶囊包含2至6个靶向部分。15.权利要求14的聚合物纳米胶囊，其中所述靶向部分包含两个或更多个不同的靶向部分。16.权利要求13的聚合物纳米胶囊，其中所述至少一个靶向部分是抗体，并且其中所述聚合物纳米胶囊包含1至3个抗体。17.前述权利要求中任一项的聚合物纳米胶囊，其进一步包含至少一个稳定化部分。18.权利要求17的聚合物纳米胶囊，其中所述至少一个稳定化部分包含至少一个聚乙二醇基团。19.前述权利要求中任一项的聚合物纳米胶囊，其中所述聚合物纳米胶囊包含至少一个靶向部分和至少一个稳定化部分。20.权利要求19的聚合物纳米胶囊，其中所述靶向部分是抗体，并且其中所述稳定化部分包含至少一个聚乙二醇基团。21.前述权利要求中任一项的聚合物纳米胶囊，其中所述聚合物壳包含至少两种带正电的单体。22.一种组合物，其包含权利要求1
‑
21中任一项的聚合物纳米胶囊和药学上可接受的载剂或赋形剂。23.一种修饰的宿主细胞，其通过使未修饰的宿主细胞与权利要求1
‑
21中任一项的聚合物纳米胶囊或权利要求22的组合物接触来制备。24.权利要求23的修饰的宿主细胞，其中所述未修饰的宿主细胞是造血干细胞，任选是CD34+造血干细胞。25.权利要求24的修饰的宿主细胞，其中所述造血干细胞是异基因造血干细胞。
26.权利要求24的修饰的宿主细胞，其中所述造血干细胞是自体造血干细胞。27.权利要求24的修饰的宿主细胞，其中所述造血干细胞是同胞匹配的造血干细胞。28.一种缀合物，其根据包括以下的方法制备：(a)合成具有聚合物壳和核糖核蛋白复合物的聚合物纳米胶囊，其中所述聚合物壳包含至少一种带正电的单体、至少一种中性单体和交联剂；(b)用靶向部分对聚合物纳米胶囊的表面官能化以提供纳米胶囊缀合物。29.一种缀合物，其根据包括以下的方法制备：(c)用能够参与点击化学反应的第一反应性官能团对聚合物纳米胶囊衍生化，所述聚合物纳米胶囊具有聚合物壳和核糖核蛋白复合物，其中所述聚合物壳包含至少一种带正电的单体、至少一种中性单体和交联剂；(d)用能够与所述第一反应性官能团参与点击化学反应的第二反应性官能团对靶向部分衍生化；和(e)使衍生化的聚合物纳米胶囊与衍生化的靶向部分反应。30.权利要求29的缀合物，其中所述靶向部分通过使所述靶向部分与具有式(IIIA)的化合物的反应来衍生化：其中A是马来酰亚胺
–
C(O)
–
；“接头”是具有2至40个碳原子且任选具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的支链或非支链、线性或环状、取代或未取代、饱和或不饱和的基团；并且B是第二反应性官能团，其选自二苯并环辛炔(“DBCO”)、反式环辛烯(“TCO”)、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、硫醇、1,3
‑
硝酮、醛、酮、肼和羟胺。31.权利要求30的缀合物，其中所述“接头”具有式(IIIB)的结构：其中d和e各自独立地是2至10的整数；t和u独立地是0或1；Q是键、O、S或N(R
c
)(R
d
)；R
a
和R
b
独立地是H、C1‑
C4烷基或卤素；R
c
和R
d
独立地是CH3或H；并且X和Y独立地是具有1至4个碳原子且任选具有一个或多个O、N或S杂原子的支链或非支链、饱和或不饱和的基团。32.权利要求29
‑
31中任一项的缀合物，其中使所述衍生化的聚合物纳米胶囊进一步与
具有式(V)的稳定化部分反应：其中B是第二反应性官能团，其选自二苯并环辛炔(“DBCO”)、反式环辛烯(“TCO”)、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、硫醇、1,3
‑
硝酮、醛、酮、肼和羟胺；Z是羟基、支链或非支链的C1‑
C4烷基、
‑
O
‑
烷基、
‑
NH2；f和g独立地是0、或者1
‑
4的整数；并且h是1
‑
24的整数。33.权利要求29
‑
32中任一项的缀合物，其中所述聚合物纳米胶囊用所述第一反应性官能团中的至少三个来衍生化。34.权利要求29
‑
33中任一项的缀合物，其中所述第一反应性官能团选自DBCO、TCO、马来酰亚胺、醛、酮、叠氮化物、四嗪、硫醇、1,3
‑
硝酮、肼和羟胺。35.权利要求29
‑
34中任一项的缀合物，其中所述第一反应性官能团包含DBCO，并且其中所述第二反应性官能团包含叠氮基团。36.权利要求29
‑
35中任一项的缀合物，其中所述靶向部分包含抗体。37.权利要求36的缀合物，其中所述抗体选自抗CD4抗体、抗CD8抗体和抗CD45抗体。38.权利要求29
‑
37中任一项的缀合物，其中所述具有第一反应性官能团的聚合物纳米胶囊通过使所述聚合物纳米胶囊与包含二硫基团的化合物反应得到。39.权利要求29
‑
38中任一项的缀合物，其中通过使所述聚合物纳米胶囊与具有式(IVA)的化合物反应，所述聚合物纳米胶囊用第一反应性官能团来衍生化：A
‑
间隔子
‑
B
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(IVA)，其中A是马来酰亚胺
–
C(O)
–
，“间隔子”是具有2
‑
20个碳原子并具有二硫键的支链或非支链、线性或环状、取代或未取代、饱和或不饱和的基团；并且B选自二苯并环辛炔(“DBCO”)、反式环辛烯(“TCO”)、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、硫醇、1,3
‑
硝酮、醛、酮、肼和羟胺。40.权利要求39的缀合物，其中所述“间隔子”具有式(IVB)的结构：其中其中d为2
‑
10的整数；t和u独立地是0或1；R
a
和R
b
独立地是H、C1‑
C4烷基或卤素；并且
X和Y独立地是具有1
‑
8个碳原子且任选具有一个或多个O、N或S杂原子的支链或非支链、饱和或不饱和的基团。41.权利要求29
‑
40中任一项的缀合物，其中所述缀合物靶向具有选自CD3、CD4、CD8和CD45的分化群标志物的细胞。42.权利要求29
‑
41中任一项的缀合物，其中所述核糖核蛋白复合物包含Cas蛋白和向导RNA。43.权利要求42的缀合物，其中所述向导RNA靶向HPRT基因座。44.权利要求43的缀合物，其中所述靶向HPRT基因座的向导RNA包含与SEQ ID NO:2具有至少90％相同性的核酸序列。45.权利要求42的缀合物，其中所述向导RNA靶向β珠蛋白基因座。46.权利要求45的缀合物，其中所述靶向β珠蛋白基因座的向导RNA包含与SEQ ID NO:3具有至少90％相同性的核酸序列。47.权利要求42的缀合物，其中所述向导RNA靶向CCR5基因座。48.权利要求47的缀合物，其中所述靶向CCR5基因座的向导RNA包含与SEQ ID NO:1具有至少90％相同性的核酸序列。49.一种组合物，其包含权利要求29
‑
48中任一项的缀合物和药学上可接受的载剂或赋形剂。50.一种修饰的宿主细胞，其通过使宿主细胞与权利要求29
‑
48中任一项的缀合物或权利要求49的组合物接触来制备。51.权利要求50的修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞是造血干细胞。52.权利要求51的修饰的宿主细胞，其中所述造血干细胞是异基因造血干细胞。53.如权利要求51的修饰的宿主细胞，其中所述造血干细胞是自体造血干细胞。54.权利要求51的修饰的宿主细胞，其中所述造血干细胞是同胞匹配的造血干细胞。55.一种治疗人个体的遗传病症的方法，其包括向所述人个体给药治疗有效量的权利要求50
‑
54中任一项的修饰的宿主细胞。56.一种聚合物纳米胶囊，其包含聚合物壳和核糖核蛋白复合物，其中所述聚合物壳包含(i)N
‑
(3
‑
((4
‑
((3
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氨基丙基)氨基)丁基)氨基)丙基)丙烯酰胺或2
‑
(二甲基氨基)乙基丙烯酸酯中的至少一种；(ii)丙烯酰胺或其衍生化物；和(iii)交联剂。57.权利要求56的聚合物纳米胶囊，其中所述聚合物壳包含N
‑
(3
‑
((4
‑
((3
‑
氨基丙基)氨基)丁基)氨基)丙基)丙烯酰胺和2
‑
(二甲基氨基)乙基丙烯酸酯。58.权利要求56
‑
57中任一项的聚合物纳米胶囊，其中所述交联剂是丙烯酸酯。59.权利要求58的聚合物纳米胶囊，其中所述丙烯酸酯是2
‑
(二甲基氨基)乙基丙烯酸酯。60.权利要求56
‑
59中任一项的聚合物纳米胶囊，其中所述聚合物纳米胶囊进一步包含至少一个靶向部分。61.权利要求60的聚合物纳米胶囊，其中所述至少一个靶向部分通过包含二硫键的间隔子偶联至所述聚合物纳米胶囊。62.权利要求60
‑
61中任一项的聚合物纳米胶囊，其中所述至少一个靶向部分是抗体。63.权利要求60
‑
62中任一项的聚合物纳米胶囊，其中所述至少一个靶向部分促进所述
聚合物纳米胶囊到特定细胞类型的递送，其中所述细胞类型选自包含以下的组：免疫细胞、血细胞、心肌细胞、肺细胞、视细胞、肝细胞、肾细胞、脑细胞、中枢神经系统的细胞、周围神经系统的细胞、癌细胞、感染病毒的细胞、干细胞、皮肤细胞、肠道细胞和/或听细胞。64.权利要求63的聚合物纳米胶囊，其中所述癌细胞选自包含以下的组：淋巴瘤细胞、实体瘤细胞、白血病细胞、膀胱癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、子宫内膜癌细胞、肾癌细胞、肺癌细胞、黑色素瘤细胞、胰腺癌细胞、前列腺癌细胞和甲状腺癌细胞。65.权利要求56
‑
64中任一项的聚合物纳米胶囊，其进一步包含至少一个稳定化部分。66.权利要求65的聚合物纳米胶囊，其中所述至少一个稳定化部分包含至少一个选自聚乙二醇重复基团和聚丙二醇重复基团的重复基团。67.权利要求65的聚合物纳米胶囊，其中所述至少一个稳定化部分包含至少两个聚乙二醇重复基团。68.权利要求56
‑
67中任一项的聚合物纳米胶囊，其中所述核糖核蛋白复合物包含靶向HPRT、γ珠蛋白启动子和/或β珠蛋白的向导RNA。69.权利要求56
‑
68中任一项的聚合物纳米胶囊，其中所述聚合物纳米胶囊的直径为约50nm
‑
约250nm。70.一种聚合物纳米胶囊，其包含聚合物壳和核糖核蛋白复合物，其中所述聚合物纳米胶囊包含至少一个适于促进所述核糖核蛋白复合物向造血干细胞的递送的靶向部分，其中所述至少一个靶向部分通过二硫键偶联至所述聚合物纳米胶囊，并且其中所述聚合物纳米胶囊进一步包含至少一个具有亲水基团的稳定化部分。71.权利要求70的聚合物纳米胶囊，其中所述核糖核蛋白复合物包含靶向HPRT、γ珠蛋白启动子和/或β珠蛋白的向导RNA。72.权利要求70
‑
71中任一项的聚合物纳米胶囊，其中所述至少一个靶向部分包含抗体。73.权利要求70
‑
72中任一项的聚合物纳米胶囊，其中所述至少一个稳定化部分的亲水基团包含聚乙二醇基团。74.权利要求70
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72中任一项的聚合物纳米胶囊，其中所述至少一个稳定化部分的亲水基团是聚丙二醇重复基团。75.权利要求70
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74中任一项的聚合物纳米胶囊，其中所述聚合物壳包含至少一种带正电的单体，所述带正电的单体选自：N
‑
(3...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：美国杰特贝林生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：