一种ZmMIR398b-pro的应用制造技术

本发明专利技术实施例公开了一种ZmMIR398b

【技术实现步骤摘要】
一种ZmMIR398b
‑
pro的应用


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及一种ZmMIR398b
‑
pro的应用。

技术介绍

[0002]玉米(Zea mays)是世界上重要的粮食和经济兼用作物，又是我国的第一大粮食作物，在耕地面积有限的背景下，提高玉米抵抗逆境胁迫能力，保证玉米高产稳产，是确保粮食安全的重要途径之一。近年来，由于全球变暖，温室效应现象日益明显，高温成为制约农作物产量的一项主要环境因素。短时间内周围环境温度的迅速升高，会形成高温胁迫，严重影响大田作物的株高、根长、生物量生产和粮食品质等，研究玉米在高温胁迫下的分子调控机制就显得尤为重要，发现新的调控高温胁迫响应的因子可为玉米优良性状改良和分子育种提供新的理论依据。
[0003]高温胁迫在自然条件下广泛存在，植物在长期的进化过程中形成了应对高温胁迫的一套保护机制，多种已报道的调控因子会响应热胁迫而提高表达水平。启动子分为组成型启动子，组织或器官特异性启动子和诱导型启动子。诱导型启动子指可根据需要在植物特定的发展阶段，组织器官或生长环境下，快速诱导基因转录的开与关。热响应的调控因子的启动子就属于诱导型启动子，能高效特异的在高温条件下启动外源基因的表达，是一个重要的载体元件。
[0004]microRNA(miRNA)在农作物生长发育中起关键调控作用，是农作物新的改良靶标。miR398属于在各物种中保守的miRNA家族，在不同物种中具有保守的靶基因Copper/zinc superoxide dismutase1(CSD1)、CSD2、Copper chaperone for superoxide dismutase(CCS)和Cytochrome c oxidase subunit 5b
‑
1(COX5b
‑
1)。拟南芥过表达miR398通过抑制靶基因的表达，导致细胞内氧化还原状态失衡，最终提高了转基因拟南芥对高温胁迫的抗性。

技术实现思路

[0005]本专利技术实施例提供一种ZmMIR398b
‑
pro的应用，应用于在热诱导时启动目的基因表达，对玉米进行热诱导的方法包括：
[0006]利用T
‑
DNA插入转基因技术构建了包含ZmMIR398b启动子融合GUS基因的表达载体及转基因植物，PCR扩增ZmMIR398b promoter核苷酸序列，并使用BamH I和NcoI双酶切PCR产物后，将ZmMIR398b启动子构建到目的载体pCAMBIA3301
‑
GUS中，其中，ZmMIR398b启动子用于在热诱导条件下GUS基因表达，ZmMIR398b启动子的3
’
端与GUS基因的上游序列连接；
[0007]通过农杆菌EHA105株系将pCAMBIA3301
‑
ZmMIR398b promoter
‑
GUS过表达载体转入玉米自交系C01的不成熟胚中得到多个转基因事件；
[0008]通过GUS组织化学染色的方法鉴定ZmMIR398b promoter在玉米热胁迫下的响应。
[0009]进一步地，使用引物PCR扩增ZmMIR398b promoter核苷酸序列时使用的引物为：MIR398b
‑
p
‑
F6和MIR398b
‑
p
‑
R4。
[0010]进一步地，MIR398b
‑
p
‑
F为gagctcggtacccggggatccATGATGTCAT GCAGTGAGGTGTCA。
[0011]进一步地，MIR398b
‑
p
‑
R4为ttaccctcagatctaccatggGCCGGAAC TGCCTTTGCG。
[0012]进一步地，还包括一种调控玉米耐热性的方法，包括：
[0013]利用T
‑
DNA插入转基因技术构建了包含两个串联重复发卡结构的ZmmiR398基因过表达载体及转基因植物，用PCR方法将ZmmiR398成熟核苷酸序列克隆并构建至pOT2
‑
Polycis
‑
UN载体，进一步将ZmmiR398构建到目的载体pZZ00026
‑
PM中，得到ZmmiR398过表达载体；
[0014]通过农杆菌EHA105株系将ZmmiR398过表达载体转入玉米自交系C01的不成熟胚中得到多个转基因事件；
[0015]对多个转基因事件分别通过Northern blot的方法鉴定ZmmiR398基因在叶片中表达量升高的独立事件，得到调控玉米耐热性的事件。
[0016]进一步地，发卡结构的ZmmiR398过表达载体包括：使用玉米泛素基因UBI驱动的人工miRNA结构和使用增强CaMV 35S启动子驱动的BAR基因结构。
[0017]进一步地，所述利用T
‑
DNA插入转基因技术构建了两个串联重复的发卡结构的ZmmiR398过表达载体，包括：
[0018]在pOT2
‑
Polycis
‑
UN载体中，将两个串联重复的具有发卡结构的ZmmiR398克隆到玉米泛素基因UBI启动子下游主干中。
[0019]进一步地，还包括：
[0020]对发卡结构的ZmmiR398过表达载体进行测序验证，并将所得的pOT2
‑
Polycis
‑
UN
‑
miR398载体经PacI和MluI限制性内切酶进行双重消化；
[0021]将消化后回收的UBI
‑
miR398
‑
NOS片段克隆到pZZ00026
‑
PM的二元载体中；
[0022]将经sanger测序验证的二元载体导入农杆菌菌株EHA105。
[0023]进一步地，在构建ZmmiR398过表达载体时采用的引物为：
[0024]OE398
‑
F:
[0025]gccATTTAAATgcagggattggCGGGGGCGATCTGAGAACACTatcggatcctcgaggtgtaaa aaaactcg；
[0026]OE398
‑
R:
[0027]ccATTTAAATagccgaattggCGGGGGCGACCTGAGAACACAatccgagcccgatggtgagac tTTT。
[0028]进一步地，对pOT2
‑
Polycis
‑
UN
‑
miR398载体测序时采用的引物为：PF
‑
2:CGACTCTAGAGGATCCAAGCTT；
[0029]PR
‑
2:GCCAAATGTTTGA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种ZmMIR398b
‑
pro的应用，其特征在于，应用于在热诱导时启动目的基因表达，所述目的基因的DNA序列与ZmMIR398b
‑
pro核苷酸序列的3'末端相连；其中，对玉米进行热诱导的方法包括：利用T
‑
DNA插入转基因技术构建了包含ZmMIR398b启动子融合GUS基因的表达载体及转基因植物，PCR扩增ZmMIR398b promoter核苷酸序列，并使用BamH I和NcoI双酶切PCR产物后，将ZmMIR398b启动子构建到目的载体pCAMBIA3301
‑
GUS中，其中，ZmMIR398b启动子用于在热诱导条件下GUS基因表达，ZmMIR398b启动子的3
’
端与GUS基因的上游序列连接；通过农杆菌EHA105株系将pCAMBIA3301
‑
ZmMIR398b promoter
‑
GUS过表达载体转入玉米自交系C01的不成熟胚中得到多个转基因事件；通过GUS组织化学染色的方法鉴定ZmMIR398b promoter在玉米热诱导过程中的作用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，还包括调控玉米耐热性的方法：利用T
‑
DNA插入转基因技术构建了包含两个串联重复发卡结构的ZmmiR398基因过表达载体及转基因植物，用PCR方法将ZmmiR398成熟核苷酸序列克隆并构建至pOT2
‑
Polycis
‑
UN载体，进一步将ZmmiR398构建到目的载体pZZ00026
‑
PM中，得到ZmmiR398过表达载体；通过农杆菌EHA105株系将ZmmiR398过表达载体转入玉米自交系C01的不成熟胚中得到多个转基因事件；对多个转基因事件分别通过Northern blot的方法鉴定ZmmiR398基因在叶片中表达量升高的独立事件，得到调控玉米耐热性的事件。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，使用引物PCR扩增ZmMIR398bpromoter核苷酸序列时使用的引物为：MIR398b
‑
p
‑
F6和MIR398b
‑
p
‑
R4。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，MIR398b
‑
p
‑
F6为gagctcggtacccggggatccATGATGTCATGCAGTGA GG TGTCA。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，MIR398b
‑
p
‑
R4为ttaccctcagat...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘琳，李晶，左志芳，何文博，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：