一种利用枯草芽孢杆菌自分泌表达外源蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用枯草芽孢杆菌自分泌表达外源蛋白的方法。通过构建KR32枯草芽孢杆菌分泌表达载体，实现无需添加外源诱导剂，即可实现分泌表达KR32；用重组表达得到的含抗菌肽KR32的上清液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等均有显著的抑制作用。本发明专利技术为在枯草芽孢杆菌表达系统中自分泌重组表达抗菌肽提供了可能；自分泌表达直接分泌至胞外，无需经过外源诱导剂诱导，避免了诱导剂的毒性，同时省去了诱导剂成本；同时直接分泌表达对宿主的生长无明显抑制作用。使用液质联用技术对枯草芽孢杆菌分泌的KR32进行检测，能够检测到目标物的峰。对21日龄仔猪灌胃该菌14天，后连续进行3天K88灌胃攻毒（1*10

【技术实现步骤摘要】
一种利用枯草芽孢杆菌自分泌表达外源蛋白的方法


[0001]本专利技术属于生物技术和基因工程
，具体的，本专利技术涉及一种利用枯草芽孢杆菌表达外源蛋白的方法。

技术介绍

[0002]随着全球范围内耐药菌的不断增加，新药研发速度远低于耐药菌的进化速度，加上化学药物的开发难度和投入费用逐渐增加，抗菌肽以其独特的优势成为今年来药物开发的研究热点。化学合成方法获取抗菌肽的成本高；直接从生物体中分离纯化则相对复杂。随着生物技术的不断发展，利用基因工程和发酵工程技术生产药物蛋白或多肽成为一种经济高效的生产方式。
[0003]目前，已有众多抗菌肽在异源宿主中表达，其中大多数的抗菌肽在大肠杆菌和酵母表达系统中表达。但大肠杆菌表达系统易形成包涵体、细胞壁含有致病性内毒素等；酵母表达系统后期大规模发酵通常需要较复杂的培养基，需要甲醇作为碳源，因而生产成本较高。枯草芽孢杆菌是一种被公认为安全的微生物。它能将重组蛋白分泌至胞外，不易形成包涵体，细胞壁无内毒素，且后期发酵成本远低于酵母表达系统。但目前在枯草芽孢杆菌中重组表达抗菌肽的报道较少。

技术实现思路

[0004]本专利技术目的是提供一种利用枯草芽孢杆菌表达外源蛋白的方法。
[0005]本专利技术所用的抗菌肽KR32对益生菌的生长无明显毒性，因此采用自分泌表达载体，直接由枯草芽孢杆菌在产生次级代谢产物（如酶和酸等）的同时分泌表达抗菌肽KR32。相比与常见的诱导融合表达策略，省去了添加了诱导剂带来的毒性问题，无需使用纯化标签进行纯化、无需使用特定的酶对融合标签进行切割，也省去了切割后再纯化的繁琐步骤，为直接应用重组枯草芽孢杆菌提供了便利。同时体内试验表明，灌胃重组菌能够有效的抵御k88攻毒导致的料重比增加，平均日增重降低。能够部分挽回仔猪因感染大肠杆菌k88带来的经济损失。
[0006]一种利用枯草芽孢杆菌自分泌表达外源蛋白的方法，包括以下步骤：1）将外源蛋白KR32基因，序列如SEQ ID NO:1所示，插入枯草芽孢杆菌自分泌表达载体pBE2R得到外源蛋白枯草芽孢杆菌自分泌表达载体pBE2R
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KR32；2）外源蛋白枯草芽孢杆菌分泌表达载体经电转导入在枯草芽孢杆菌B. subtilis WB800，构建得到了B. subtilis WB800/pBE2R
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KR32菌株，用于高效表达，分泌外源蛋白。
[0007]所述的方法，使用液质联用技术对构建的B. subtilis WB800/pBE2R
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KR32的发酵上清进行检测，该检测限低至10ppb，而液相色谱技术的检出限为50ppm。
[0008]所述的方法，在仔猪上的试验灌胃B. subtilis WB800/pBE2R
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KR32菌株14天，后连续进行3天K88灌胃攻毒，1*10
10 cfu/d，能够有效的抵御k88攻毒导致的料重比增加，平均
日增重降低，与空白对照组无显著差异。
[0009]本专利技术的有益效果：1. 首次在枯草芽孢杆菌表达系统中成功表达具有活性的KR32，为使用自分泌表达载体在枯草芽孢杆菌表达系统中祖冲表达抗菌肽提供了可能。
[0010]2. 使用本专利技术在重组表达抗菌肽时，无需经过诱导剂诱导，直接分泌至胞外，并且重组抗菌肽不含内毒素，省去了大量下游纯化的工作。
[0011]3. 使用本专利技术表达抗菌肽未见对宿主有毒性作用。
附图说明
[0012]图1是WB800，WB800
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pBE2R，WB800
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pBE2R
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KR32的生长曲线图。
[0013]图2是western blot分析24
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39h枯草芽孢杆菌表达系统分泌上清中KR32
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EGFP表达水平图。泳道1
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9，24
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39h分泌上清中的KR32
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EGFP。
[0014]图3是使用牛津杯法检测24
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39h不同时段所收集的上清对大肠杆菌的抑制作用图；图中，A:10 μg/mL 氨苄; B:24h; C:27h; D:30h; E:33h; F:36h; G: 39h。
[0015]图4是使用牛津杯法检测33h时，不同载体和处理对大肠杆菌的抑制作用图；图中，A：10 μg/mL 氨苄；B：WB800；C：空载体；D：重组菌；E：LB液体培养基。
[0016]图5是使用液质联用技术对KR32标准品进行检测图。
[0017]图6是使用液质联用技术对发酵液上清检测图。
具体实施方式
[0018]以下结合附图和实施例对本专利技术做进一步的说明。
[0019]本专利技术不仅在枯草芽孢杆菌中重组表达了抗菌肽，而且成功表达了包含抗菌肽的融合绿色荧光蛋白。
[0020]实施例1 pBE2R
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KR32在枯草芽孢杆菌中的高效表达重组表达菌株 B. subtilis WB800/pBE2R和B. subtilis WB800/pBE2R
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KR32的构建所述的蛋白基因为KR32基因，为根据KR32氨基酸序列合成的KR32基因。将载体pBE2R用电击转化法转化至枯草芽孢杆菌WB800中，得到表达菌株B. subtilis WB800/pBE2R。
[0021]所述的KR32基因序列为如序列表SEQ ID NO:1所示，基因序列根据密码子优化原则进行了优化，使其能够在宿主枯草芽孢杆菌中能够最优进行表达。密码子适应指数上调到0.98（密码子适应指数在0.8
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1.0之间被认为是对于高表达有益），平均GC含量调整到38.57%，去除了不理想的峰。为了在mRNA中避免茎环结构，原始序列中重复的面积已经去除。不理想的改变，如在亚克隆的限制酶位点和消极的顺式作用位点被改造了。微调全长序列增加其转译效益并延长mRNA的半衰期。基因合成得到抗菌肽KR32基因，将基因插入枯草芽孢杆菌自分泌表达载体pBE2R的BamHI与HindIII之间，得到抗菌肽重组表达载体pBE2R
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KR32。将载体pBE2R
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KR32用电击转化法转化至枯草芽孢杆菌WB800中，得到表达菌株得到B. subtilis WB800/pBE2R
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KR32。如图1所示，与B. subtilis WB800和B. subtilis WB800
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pBE2R相比，构建的重组菌B. subtilis WB800/pBE2R
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KR32生长状态没有受到显著抑制。
[0022]实施例2 pBE2R
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KR32
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EGFP在枯草芽孢杆菌中的高效表达重组表达菌株 B. subtilis WB800/pBE2R
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KR32
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EGFP的构建所述的融合蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用枯草芽孢杆菌自分泌表达外源蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）将外源蛋白KR32基因，序列如SEQ ID NO:1所示，插入枯草芽孢杆菌自分泌表达载体pBE2R得到外源蛋白枯草芽孢杆菌自分泌表达载体pBE2R
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KR32；2）外源蛋白枯草芽孢杆菌分泌表达载体经电转导入在枯草芽孢杆菌B. subtilis WB800，构建得到了B. subtilis WB800/pBE2R
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KR32菌株，用于高效表达，分泌外源蛋白。...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪以真，文超越，张红，靳明亮，王凤芹，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：