一种基于双组分群体感应元件的枯草芽孢杆菌自诱导基因表达系统技术方案

本发明专利技术公开一种基于双组分群体感应元件的枯草芽孢杆菌自诱导基因表达系统，属于基因工程技术领域。开发一种持久和高表达的自诱导基因表达系统。本发明专利技术提供一种自诱导基因的表达系统，所述表达元件由组成型启动子和靶标启动子、agrA基因的RBS序列和/或agrD基因的RBS序列、编码应答调节蛋白基因agrA、编码信号分子AIP前体基因agrD、编码信号加工蛋白的基因agrB和编码与信号分子结合并启动信号传导的传感蛋白基因agrC组成。本发明专利技术对设计基于枯草芽孢杆菌的重组蛋白表达体系提供了一种新的思路和方法。思路和方法。思路和方法。

【技术实现步骤摘要】
一种基于双组分群体感应元件的枯草芽孢杆菌自诱导基因表达系统


[0001]本专利技术属于基因工程
，主要涉及一种基于双组分群体感应元件的枯草芽孢杆菌自诱导基因表达系统。

技术介绍

[0002]随着基因工程、合成生物学的发展，人们通过在细胞中构建基因电路来实现对细胞进行遗传操作，这在合成生物学研究中具有重要的作用。传统的表达调控系统可以在转录水平实现调控，但需要外源添加诱导剂来进行调控，常见的诱导剂有由乳糖、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、木糖等，不过，诱导型的表达系统种类依然很少，性能依然不能满足大规模工业生产的要求，并且外源添加的诱导剂会大幅度提高生产成本。此外，细胞内的所有代谢活动是动态而复杂的，而这种调控策略与底盘细胞的生长耦合，所以在细胞中构建人工静态调控系统往往会对底盘细胞造成干扰，例如，外源基因的过度表达可能造成宿主无法正常生长；中间有毒产物的大量积累可能对细胞产生毒害作用，甚至导致细胞死亡。有时需要生产特殊的化合物，例如在合成具有细胞毒性的产物时，通常需要宿主生长到较高的细胞密度时再从生长转换为生产模式，从而尽可能减少产物对细胞的毒害作用。因此，开发自诱导的基因表达调控电路对代谢工程及蛋白质工程依然十分重要。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的为了开发一种持久和高表达的自诱导基因表达系统。
[0004]本专利技术提供一种自诱导基因的表达元件，所述表达元件由组成型启动子和靶标启动子、agrA基因的RBS序列和/或agrD基因的RBS序列、编码应答调节蛋白基因agrA、编码信号分子AIP前体基因agrD、编码信号加工蛋白的基因agrB和编码与信号分子结合并启动信号传导的传感蛋白基因agrC组成。
[0005]进一步地限定，所述agrD基因的RBS序列如SEQ ID NO.16或SEQ ID NO.17所示；所述agrA基因的RBS序列如SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20或SEQ ID NO.21。
[0006]进一步地限定，组成型启动子分别为组成型启动子Pveg和组成型启动子P43，靶标启动子为P3启动子，载体为pHT01。
[0007]进一步地限定，连接顺序为：组成型启动子P43与agrA基因RBS和agrA基因依次连接，P3启动子与多克隆位点连接，组成型启动子Pveg与agrD基因RBS和agrD基因依次连接，组成型启动子Pveg被置于P43启动子的上游，agrB基因和agrC基因与多克隆位点连接。
[0008]本专利技术提供上述的自诱导基因的表达元件的重组载体。
[0009]本专利技术提供一种制备上述的表达元件的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：将含有组成型启动子、agrA基因的RBS序列和/或agrD基因的RBS序列、编码应答调节蛋白基因agrA、编码信号分子AIP前体基因agrD的载体转化到整有agrB基因和agrC基因的微生物细胞。
[0010]本专利技术提供一种自诱导基因的表达系统，含有上述的自诱导基因的表达元件的微生物细胞。
[0011]进一步地限定，所述微生物细胞为革兰氏阳性菌的微生物细胞。
[0012]进一步地限定，微生物细胞为枯草芽孢杆菌。
[0013]本专利技术提供上述的表达元件或上述的表达系统在食品、化工和制药领域中的应用。
[0014]有益效果：金黄色葡萄球菌Agr系统是一种介导群体感应的双组分系统，通过受体组氨酸激酶感应环肽信号分子AIP，经过磷酸化级联激活靶标启动子，调控靶基因的表达时机。基于对Agr双组分信号系统的研究，可以在枯草芽孢杆菌中重构了Agr，将之设计成为自诱导基因表达系统。
[0015]枯草芽孢杆菌B.subtilis是重要的工业酶高效表达平台和代谢工程底盘微生物，在B.subtilis中构建与生长相偶联的动态基因表达系统在代谢工程中的应用十分重要。如果利用内源的群体感应系统对基因表达进行调控，会严重影响其细胞生长等重要的生理过程。所以异源重构正交性较好的人工群体感应系统具有重大的意义。
[0016]本专利技术首先在枯草芽孢杆菌中重构了金黄色葡萄球菌Agr双组分系统，构建出自诱导肽(AIP)驱动的自诱导基因表达系统AgrQS。并利用RBS工程对关键蛋白元件AgrA蛋白的表达水平进行单一以及与信号分子AgrD表达水平共同进行两基因组合调控，实现自诱导系统激活时机、时间动态以及表达输出水平的调节。本专利技术对设计基于枯草芽孢杆菌的重组蛋白表达体系提供了一种新的思路和方法。
附图说明
[0017]图1：基于agr群体感应元件的枯草芽孢杆菌自诱导AgrQS表达系统构建示意图。
[0018]图2：AgrQS的功能验证；a是异源构建AgrQS系统的荧光强度检测；b是SDS
‑
PAGE蛋白表达检测；
[0019]图3：通过RBS工程，调节agrA的表达水平，并确证其对agrA表达水平的变化对AgrQS系统激活时间动态的影响；
[0020]图4：agrD和agrA表达水平共调节体系转化子第一次筛选；
[0021]图5：agrD和agrA表达水平共调节体系的转化子第二次筛选；
[0022]图6：验证agrD和agrA表达水平共调节对AgrQS系统时间动态的作用。
具体实施方式
[0023]下述实施例涉及的培养基如下：
[0024]1.培养基：
[0025]LB固体培养基：LB液体培养基中加入1.5
‑
2％的琼脂粉用于菌体的筛选、活化和平板培养等。
[0026]SP
‑Ⅰ
培养基(10mL)：4.9mL SPA溶液，4.9mL SPB溶液，100μL 50％葡萄糖溶液，100μL 100
×
CAYE溶液混匀，现用现配。
[0027]SP
‑Ⅱ
培养基(4mL)：4.92mL SP
‑Ⅰ
培养基，40μL 50mmol
·
L
‑
1CaCl2溶液，40μL 250mmol
·
L
‑
1MgCl2溶液混匀，现用现配。
[0028]本专利技术中涉及的相关抗生素的终浓度：氨苄青霉素(Amp)100μg
·
mL
‑
1氯霉素(Chl)10μg
·
mL
‑1[0029]2.SDS
‑
PAGE蛋白检测：
[0030]取出保藏的甘油菌，在LB琼脂培养基平板上分区划线，放置37℃培养箱中过夜培养。从平板上挑取单菌落接至含有3mL LB液体培养基的小试管中，37℃，200r
·
min
‑
1过夜培养，再以1％接种量转接至含LB大试管中，37℃，200r
·
min
‑
1培养12h。吸取200μL培养液，12,000r
·
min
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种自诱导基因的表达元件，其特征在于，所述表达元件由组成型启动子和靶标启动子、agrA基因的RBS序列和/或agrD基因的RBS序列、编码应答调节蛋白基因agrA、编码信号分子AIP前体基因agrD、编码信号加工蛋白的基因agrB和编码与信号分子结合并启动信号传导的传感蛋白基因agrC组成。2.根据权利要求1所述的表达元件，其特征在于，所述agrD基因的RBS序列如SEQ IDNO.16或SEQ ID NO.17所示；所述agrA基因的RBS序列如SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20或SEQ ID NO.21。3.根据权利要求1所述的表达元件，其特征在于，组成型启动子分别为组成型启动子Pveg和组成型启动子P43，靶标启动子为P3启动子，载体为pHT01。4.根据权利要求1所述的表达元件，其特征在于，连接顺序为：组成型启动子P43与agrA基因RBS和agrA基因依次连接，P3启动子与多克隆位点连接，组成型启动子Pveg与agrD基因RBS和agrD基因依次连接，组成...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔文璟，张雨晴，伍义，周哲敏，胡瑞淳，韩来闯，郭品增，王馨苒，段誉，邵梦圆，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：