同时检测多种病原体基因的方法和试剂盒技术

本公开描述了一种同时检测多种病原体基因的方法和试剂盒，是对各个病原体基因的靶标区域进行检测的方法和试剂盒，方法包括以下步骤：准备待测核酸样本；向待测核酸样本加入第一正向引物、第一反向引物、第二反向引物和人工质粒集合并进行第一轮PCR扩增以得到第一轮PCR扩增产物；其中，人工质粒基于靶标区域的序列设计并异于靶标区域的序列；向第一轮PCR扩增产物加入第二正向引物和第三反向引物并进行第二轮PCR扩增以得到目标文库；对目标文库进行测序以获取测序数据，测序数据包括目标文库的序列；以及基于目标文库的序列和预定拷贝数判断病原体是否被检出以及得到病原体的拷贝数。根据本公开，能够降低引物二聚体，且能够对病原体进行定量检测。对病原体进行定量检测。对病原体进行定量检测。

【技术实现步骤摘要】
同时检测多种病原体基因的方法和试剂盒


[0001]本专利技术涉及基因检测领域，具体涉及一种同时检测多种病原体基因的方法和试剂盒。

技术介绍

[0002]聚合酶链反应（即PCR）是一种广泛运用于分子诊断的技术，用于放大扩增特定的DNA片段，可看作是生物体外的特殊DNA复制。PCR的最大特点是将样品中微量的DNA大幅增加，达到可检测的水平。伴随着测序技术，尤其是下一代测序技术（即NGS技术）的发展，对PCR产物进行高灵敏度及高分辨率的检测成为了可能，因此多重PCR可同步扩增的片段数量上限演变为多重PCR自身体系的限制。不同于传统仅仅进行3
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5重，至多15重的PCR反应体系，上千重甚至上万重的超多重PCR（high
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multiplex PCR或ultrahigh
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multiplex PCR）的实现辅以NGS测序，形成的靶向
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NGS技术（即tNGS技术）已逐渐在传染病筛查、遗传病诊断、肿瘤基因检测等领域发挥作用。
[0003]超多重PCR希望实现较好的扩增性能，需要本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时检测多种病原体基因的方法，是对各个病原体基因的靶标区域进行检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：准备待测核酸样本；向所述待测核酸样本加入第一正向引物、第一反向引物、第二反向引物和人工质粒集合并进行第一轮PCR扩增以得到第一轮PCR扩增产物；其中，所述第一正向引物包括第一测序引物和与所述靶标区域5
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端相匹配的序列；所述第一反向引物包括第二测序引物和与所述靶标区域3
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端相匹配的序列；所述第二反向引物包括所述第二测序引物、第一条形码和第一测序接头；所述人工质粒集合包括多种具有预定拷贝数的并能够与所述第一正向引物和所述第一反向引物结合的人工质粒，所述人工质粒基于所述靶标区域的序列设计并异于所述靶标区域的序列；向所述第一轮PCR扩增产物加入第二正向引物和第三反向引物并进行第二轮PCR扩增以得到目标文库；其中，所述第二正向引物包括第二测序接头和所述第一测序引物；所述第三反向引物包括所述第一测序接头；对所述目标文库进行测序以获取测序数据，所述测序数据包括所述目标文库的序列，所述目标文库的序列包括所述第一条形码的序列；以及基于所述第一条形码的序列识别所述待测核酸样本，基于所述目标文库的序列和所述预定拷贝数判断所述病原体是否被检出以及得到所述病原体在所述待测核酸样本中的含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，基于所述目标文库的序列得到所述靶标区域的读段数和所述人工质粒的读段数，并基于所述预定拷贝数、所述靶标区域的读段数和所述人工质粒的读段数得到所述靶标区域的拷贝数，由此得到所述病原体的拷贝数。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人工质粒基于所述靶标区域的序列，通过增加序列、减少部分序列或替换部分序列的方式设计得到。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，从每个病原体选取得到多个靶标区域，所述多个靶标区域之间互不重叠或仅部分重叠，对每个病原体的所述多个靶标区域进行检测，并基于所述多个靶标区域的检测结果判断所述病原体是否被检出。5.根据权利要求4所述的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：王艳平，雷湘华，苏莹，叶苑青，郭永超，徐仲尧，蔡锦刚，
申请(专利权)人：深圳联合医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：