一种提高GDP-L-岩藻糖产量的基因工程菌制造技术

本发明专利技术涉及一种提高GDP

【技术实现步骤摘要】
一种提高GDP
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L
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岩藻糖产量的基因工程菌


[0001]本专利技术涉及一种提高GDP
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L
‑
岩藻糖产量的基因工程菌，属于基因工程


技术介绍

[0002]GDP
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L
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岩藻糖是一种核苷酸的活化形式，是生产诸多重要物质的供体，在多种生物学功能中均起着重要作用，如合成L
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岩藻糖、2
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FL等。GDP
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L
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岩藻糖还是某些微生物(如大肠杆菌)合成细胞荚膜异多糖酸的中间产物，是一种重要的生物组成成分。野生型菌株合成GDP
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L
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岩藻糖的量非常少，无法满足工业化生产需求。因此，提高胞内GDP
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L
‑
岩藻糖积累量至关重要。
[0003]现有技术中，通常采用从头合成途径来合成GDP
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L
‑
岩藻糖。以大肠杆菌为例，GDP
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L
‑
岩藻糖在大肠杆菌内的从头合成途径包括：
[0004]葡萄糖
→
葡萄糖
‑6‑
磷酸
→
果糖
‑6‑
磷酸
→
甘露糖
‑6‑
磷酸
→
甘露糖
‑1‑
磷酸
→
GDP
‑
甘露糖/>→
GDP
‑4‑
酮基
‑6‑
脱氧甘露糖
→
GDP
‑
L
‑
岩藻糖。
[0005]目前在加强基因表达上有两种方式：一种是插入目的基因序列，增加目的基因的拷贝数，但这种方法会让细菌的增强效果较低；另一种是在合成催化反应酶的基因前加入强启动子，加强该基因的表达，常见的加强表达的启动子包括T7启动子、J23119启动子等，但由于强启动子的强效表达，往往会使得目的基因后的非必要基因也发生强化，从而引起细菌在非必要基因上耗费大量能量，给细菌生长带来负担，影响细菌的正常生长，进而可能会在后续的发酵中造成细菌表达目的产物较低，产量下降，对于以提高GDP
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L
‑
岩藻糖为目的的基因改造而言，这是不容忽视的问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于解决上述现有技术的不足，提供一种提高GDP
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L
‑
岩藻糖产量的基因工程菌。
[0007]技术方案
[0008]manB基因是大肠杆菌内本身就存在的一个基因，manB基因主要合成甘露聚糖酶，甘露聚糖酶可以将甘露糖
‑6‑
磷酸合成为甘露糖
‑1‑
磷酸，manC基因则负责合成gdp
‑
甘露糖焦磷酸化酶，gdp
‑
甘露糖焦磷酸化酶会将甘露糖
‑1‑
磷酸与GTP结合，进而合成GDP
‑
甘露糖，这两个合成过程是合成GDP
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L
‑
岩藻糖的关键步骤之一。为了提高manB基因与manC基因的表达，专利技术人在manB基因的前端提供一个用于增加manB基因与manC基因表达的强启动子，增加后续manB与manC基因的表达，从而提高后续产物的合成，而考虑到在合成GDP
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L
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岩藻糖时不需要manB、manC基因位点上后续基因的表达，在manB与manC基因后插入终止子，来结束后续基因的表达，减少大肠杆菌因后续基因的表达造成GDP
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L
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岩藻糖的分解与消耗。另一方面，由于wcaJ基因合成的磷酸十一碳烯基葡萄糖磷酸转移酶会将GDP
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L
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岩藻糖转化为可拉酸，这会大大减少以GDP
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L
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岩藻糖为材料的L
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岩藻糖合成量，不利于大肠杆菌合成L
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岩藻糖，因此专利技术人考虑将其中的wcaJ基因敲除，或降低wcaJ基因的表达，减少GDP
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L
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岩藻糖
的其他消耗途径。具体方案如下：
[0009]一种提高GDP
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L
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岩藻糖产量的基因工程菌：以大肠杆菌为出发菌株，敲除磷酸十一碳烯基葡萄糖磷酸转移酶编码基因wcaJ，并在gdp
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甘露糖焦磷酸化酶编码基因manC后插入终止子，获得提高GDP
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L
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岩藻糖产量的基因工程菌；所述磷酸十一碳烯基葡萄糖磷酸转移酶编码基因wcaJ的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述gdp
‑
甘露糖焦磷酸化酶编码基因manC的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]进一步，所述敲除磷酸十一碳烯基葡萄糖磷酸转移酶编码基因wcaJ是通过采用CRISPR
‑
Cas9基因编辑方法来实现的。
[0011]进一步，所述终止子为λ
‑
TL3终止子，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0012]进一步，所述出发菌株选自BL21、JM109、JM109(DE3)、BL21(DE3)、K12或MG1655。
[0013]上述提高GDP
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L
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岩藻糖产量的基因工程菌在发酵生产GDP
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L
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岩藻糖中的应用。
[0014]上述提高GDP
‑
L
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岩藻糖产量的基因工程菌的构建方法：首先构建一个用于敲除wcaJ的质粒，接着将终止子插入至表达的manC基因后，确定位点后构建目的质粒，随后对构建成功的质粒进行测序，保证质粒上不会有任何碱基发生问题，在质粒完全构建成功后将质粒电转入待构建的菌株中，最后鉴定。
[0015]本专利技术的有益效果：
[0016]本专利技术的工程菌株相较于其他构建菌株，阻断了后续非必要基因的表达，大大减少了菌株在其他途径消耗太多物质与能量，降低了菌株的生存压力，使得菌株可以将大量精力放在合成目的产物GDP
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L
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岩藻糖上，提高了GDP
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L
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岩藻糖的产量。
附图说明
[0017]图1为实施例1构建的目标质粒318
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JC2KR.PTD(BLD)的质粒图谱。
具体实施方式
[0018]下面结合附图和具体实施例对本专利技术的技术方案作进一步说明。
[0019]需要说明的是，下述实施例中，所用到的实验技术与实验方法，如无特别说明，均为本领域常规技术方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高GDP
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L
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岩藻糖产量的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为出发菌株，敲除磷酸十一碳烯基葡萄糖磷酸转移酶编码基因wcaJ，并在gdp
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甘露糖焦磷酸化酶编码基因manC后插入终止子，获得提高GDP
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L
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岩藻糖产量的基因工程菌；所述磷酸十一碳烯基葡萄糖磷酸转移酶编码基因wcaJ的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述gdp
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甘露糖焦磷酸化酶编码基因manC的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.如权利要求1所述提高GDP
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L
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岩藻糖产量的基因工程菌，其特征在于，所述敲除磷酸十一碳烯基葡萄糖磷酸转移酶编码基因wcaJ是...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘振云，倪磊，程丰伟，
申请(专利权)人：苏州一兮生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：