一株生产阳离子型生物多糖絮凝剂的重组菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株生产阳离子型生物多糖絮凝剂的重组菌及其应用。该重组菌以柠檬酸杆菌为出发菌株，引入编码1,5

【技术实现步骤摘要】
一株生产阳离子型生物多糖絮凝剂的重组菌及其应用


[0001]本专利技术属于生物合成领域，为阳离子生物多糖絮凝剂改合成
，特别是由细菌发酵制备得到的一种高分子量阳离子生物多糖絮凝剂制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]当前，工业上常用的絮凝剂可分为两种：无机絮凝剂与有机絮凝剂。其中无机絮凝剂包括明矾(硫酸铝)、氯化铁、硫酸亚铁以及石灰。其中的铝盐絮凝剂存在形成的絮体较轻、沉淀性能较差、残留物对人体有害等问题；铁盐絮凝剂也存在出水残留、二次污染等问题。有机絮凝剂中聚丙烯酰胺中残留的少量丙烯酰胺单体则具有神经毒性以及强致癌性。值得注意的是随着社会的不断发展，人们对于环境的要求不断提高使得可持续性成为污水处理技术的一个重要考虑因素。因此相较于无机絮凝剂，具有环境友好特点的天然絮凝剂的优势愈专利技术显。目前，具有良好生物相容性的天然絮凝剂主要包括淀粉、明胶、纤维素、海藻酸钠、壳聚糖、单宁以及树胶等。
[0003]絮凝剂对污水种的悬浮物的絮凝机理主要包括电荷中和、静电电荷修补、聚合物桥接以及聚合物吸附等。在不进行化学改性的情况下，多数天然絮凝剂都是非离子型，这限制了这些絮凝剂的使用场景。壳聚糖，其拥有较高的分子量以及高阳离子密度，具有一些列引人注目的物理、化学及生物特性。由于壳聚糖含有的氨基与羟基官能团，其显示出独特的聚阳离子、螯合和成膜特性。当壳聚糖溶解在酸性环境时，链上的氨基可发生质子化，聚合物变成阳离子聚合物，可与多种类型的分子相互作用。目前壳聚糖应用范围非常广泛，例如生物医学、美容、造纸、污水处理、农业或制药应用等。尤其是其具有的无毒、生物相容性和可降解性等的特点，使得其在水处理方面得到了广泛的关注。在水处理领域，尤其是在吸附及絮凝领域，壳聚糖都是一种非常有应用价值的生物相容性材料。
[0004]根据现有文献报道，在弱酸性条件下，壳聚糖对于多种染料具有优异的去除效率，例如酸黑1、酸紫5、活性黑5、酸蓝色92以及刚果红等染料。在酸性条件下，壳聚糖除了可以絮凝阴离子悬浮颗粒，去除有色废水以及降低饮用水的浊度外，壳聚糖还可作为螯合剂去除工业污水中的多种重金属离子，尤其是对于Mn(II)、Zn(II)、As(V)、As(III)、Cu以及Cr等离子具有较高的去除率。壳聚糖还可对包括藻类在内多种微生物的生长起到抑制作用。壳聚糖可通过多种方式抑制细菌。细胞壁通常由肽聚糖组成，肽聚糖上丰富的羧基往往使其带有负电荷，二带有正电荷的壳多糖絮凝剂则可在静电力的作用下与带有负电荷的细菌细胞壁紧密结合，壳聚糖与细菌结合后可通过交联限制细菌移动。在壳聚糖对微生物起到抑制作用时，其在哺乳动物细胞则表现出较低的毒性。
[0005]壳聚糖在水处理领域具有众多优点的同时也存在一些问题，影响了其使用范围。当前限制壳聚糖的使用范围主要有两点原因，一是成本原因，二是溶解度较低。因此，通过合成生物学方法，可以合成出类似壳聚糖的阳离子多糖化学物，也可以降低成本，通过分子结构调整来增加其水溶解度。更重要的是，在双碳下，通过合成生物方法可以将CO2作为底物参与到目标产物的合成当中。

技术实现思路

[0006]厨余垃圾中的油脂经过脂肪酸的β氧化产生大量的还原氢以及乙酰辅酶A，在还原氢的压力下，本专利技术利用柠檬酸杆菌，以二氧化碳作为电子受体，将一分子的乙酰辅酶A、二氧化碳以及两分子还原氢转化为丙酮酸，再经过糖异生将二氧化碳引入到多糖的合成。在这一过程中，由于柠檬酸杆菌同化二氧化碳合成阳离子多糖的过程中需要消耗大量ATP。而厌氧条件下ATP的短缺限制了柠檬酸杆菌的多糖合成。因此，我们构建重组柠檬酸杆菌，可以在厌氧条件下，以二氧化碳为底物，大量合成目标阳离子多糖。合成的该多糖絮凝剂具有良好的抑菌、絮凝等功能。该专利技术的生产工艺简单，易控制，可生物降解、性能优异，适用范围广，具有很高的应用价值和广泛的市场前景。
[0007]为了解决厌氧条件下ATP的短缺限制了柠檬酸杆菌的多糖合成的技术问题，首先引入菌紫红质能够使柠檬酸杆菌利用光能形成的质子浓度差合成ATP,进而促进其生长并加快代谢产物的积累。此外该柠檬酸杆菌还具有利用氢气的能力，在将氢气转化为胞内还原氢的过程中会偶联ATP的合成。据报道，在柠檬酸杆菌中，每同化一分子氢气将伴随0.4分子ATP的形成。过多的还原氢会进一步推动二氧化碳的利用速率。为了最大化利用氢气及光照的能量，在柠檬酸杆菌中，引入cbbM与prkA基因，搭建固定二氧化碳的CBB循环，利用氢气及ATP进一步增加二氧化碳的固定量，减少有机碳的用量。此外，该菌株中乙醛酸循环的关键基因aceB能够将两分子乙酰辅酶A转化为一分子二氧化碳以及一分子丙酮酸。不仅产生了内源二氧化碳，还进一步降低了有机碳的利用效率，因此还需敲除该基因以减少内源二氧化碳的形成。
[0008]因此，本专利技术提供了一种重组柠檬酸杆菌，其通过将编码1,5
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二磷酸核酮糖羧化酶的基因(例如，cbbM基因)、编码磷酸核酮糖激酶的基因(例如，PRKA/PKA基因)引入到菌柠檬酸杆菌中，然后将原有苹果酸合酶aceB基因的敲除；最后引入编码菌紫红质的基因(例如，bop基因)而得到。
[0009]本专利技术的重组柠檬酸杆菌中，优选地，所述出发菌柠檬酸杆菌可为Citrobacter NK02。
[0010]本专利技术的重组柠檬酸杆菌中，所述编码1,5
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二磷酸核酮糖羧化酶的基因,可以是能够催化1,5
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二磷酸核酮糖与二氧化碳的羧化反应或与氧气的氧化反应的基因，其实例可包括来自光合异养菌深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)的cbbM基因。优选地，所述编码1,5
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二磷酸核酮糖羧化酶的基因可以如SEQ：1所述，或者是将SEQ：1经过一个或几个核苷酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由SEQ：1衍生的DNA分子。
[0011]所述cbbM基因序列为：
[0012]aagttaagaggcaagaatgcatcatcaccatcaccacatggaccagtcatctcgttacgtcaatctggcgctcaaggaagaggatctgatcgccggcggcgagcatgtgctttgtgcctatatcatgaagcccaaggccggatatggctatgtggcgaccgcggcgcatttcgccgccgagagttcgacgggcaccaacgtcgaggtctgcaccaccgacgatttcacccggggcgtcgacgccctggtctatgaggtggacgaggcccgcgagctgaccaagatcgcctatccggtggctttgttcgaccgcaacatcaccgacggcaaggcgatgatcgcctcgttcctgacgctcaccatgggaaacaaccagggtatgggcgacgtggaatacgccaagatgcacgatttctatgtgcccgaggcttatcgcgccctgtttgatggcccgagcgtcaatatct本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.重组菌，该重组菌以柠檬酸杆菌为出发菌株，引入编码1,5
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二磷酸核酮糖羧化酶的基因、引入编码磷酸核酮糖激酶的基因，敲除苹果酸合酶aceB基因，最后引入编码菌紫红质的基因。2.如权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述编码1,5
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二磷酸核酮糖羧化酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID.1所示；所述编码磷酸核酮糖激酶的基因如SEQ ID.3所示；所述编码菌视紫红质的基因如SEQ ID.5所示；苹果酸合酶的基因如SEQ ID.7所述。3.一种权利要求1或2所述的重组菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：第一步：CBB循环的搭建以及aceB基因的敲除：1.1cbbM及prkA基因的克隆；1.2通过PCR扩增aceB(GEN2534)上下游各500bp同源区；1.3以pkd4质粒为模板，通过PCR扩增两端带有FRT位点的KanR抗性基因片段，作为重组克隆筛选标志；1.4随后通过Gibson Assembly将片段连接将aceB上游同源臂、cbbM、ldh启动子、prkA、带有FRT位点的KanR抗性片段以及aceB下游同源臂，按顺序连接起来并利用高保真酶进行扩增，获得基因打靶片段；1.5利用γ
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Red系统，利用电转仪将打靶片段送入到带有pkd46质粒的柠檬酸杆菌感受态当中，孵育一段时间后筛选重组菌株；第二步：菌紫红质的引入：以Halobacterium salinarum菌的菌紫红质基因为模板，通过长片段合成经过密码子优化的菌紫红质基因片段；在经过PCR扩增后，通过over
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【专利技术属性】
技术研发人员：夏文杰，靳天志，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：