本发明专利技术公开了一种恶臭假单胞菌工程菌及其制备方法和应用，该恶臭假单胞菌工程菌，包括恶臭假单胞菌和导入恶臭假单胞菌的重组质粒；恶臭假单胞菌的基因组中敲除了影响乙二醇代谢的关键基因；重组质粒包含SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.6所示的对苯二甲酸分解代谢模块；或SEQ ID NO.4所示的对苯二甲酸分解代谢模块和SEQ ID NO.3所示的对苯二甲酸转运模块。本发明专利技术以恶臭假单胞菌为出发菌株，通过敲除影响乙二醇代谢的关键内源基因，并在此基础上外源导入对苯二甲酸代谢模块和对苯二甲酸转运模块，得到了恶臭假单胞菌工程菌；该恶臭假单胞菌工程菌可以高效共利用对苯二甲酸与乙二醇。菌工程菌可以高效共利用对苯二甲酸与乙二醇。菌工程菌可以高效共利用对苯二甲酸与乙二醇。
【技术实现步骤摘要】
一种恶臭假单胞菌工程菌及其制备方法和应用
[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种恶臭假单胞菌工程菌及其制备方法和应用。
技术介绍
[0002]由对苯二甲酸(TPA)和乙二醇(EG)聚合而成的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)，是人类生活中最广泛使用的塑料之一。PET的不恰当回收会造成严重的环境问题，而生物法升级回收是近年来全球关注的热点问题。
[0003]PET的完全降解是从人工微生物联合体的模式开始发展的，即构建一个PET降解模块，一个EG转化模块和一个TPA转化模块来执行不同的功能，可以加速PET的降解，并实现其完全转化。然而微生物联合体需要较为复杂的混合模式，不利于实际应用。PET生物降解的瓶颈之一是利用同一株菌同时将TPA与EG高效分解代谢。
[0004]恶臭假单胞菌ATCC 47054(即Pseudomonas putida KT2440)是近年来引起学者广泛兴趣的一种新的合成生物学底盘，已被用于代谢难降解底物，包括木质素和石油基塑料等。但是，该菌株不能以对苯二甲酸为唯一碳源生长，极大地限制了其在PET生物降解领域的应用。
[0005]本专利技术旨在提出一种新型改造策略，赋予恶臭假单胞菌高效共利用对苯二甲酸与乙二醇的能力。
技术实现思路
[0006]本专利技术提供了一种恶臭假单胞菌工程菌及其制备方法和应用，该恶臭假单胞菌工程菌能够同时高效地利用乙二醇和对苯二甲酸，用于实现PET的高效生物降解。
[0007]具体技术方案如下：
[0008]一种恶臭假单胞菌工程菌，包括恶臭假单胞菌和导入恶臭假单胞菌的重组质粒；所述恶臭假单胞菌的基因组中敲除了影响乙二醇代谢的关键基因；
[0009]所述重组质粒为以下之一：
[0010](1)包含如SEQ ID NO.2所示的对苯二甲酸分解代谢模块；
[0011](2)包含如SEQ ID NO.6所示的对苯二甲酸分解代谢模块；
[0012](3)包含如SEQ ID NO.4所示的对苯二甲酸分解代谢模块和如SEQ ID NO.3所示的对苯二甲酸转运模块。
[0013]其中，SEQ ID NO.2所示的对苯二甲酸分解代谢模块来源于阴城假单胞菌(Pseudomonas umsongensis)GO16(GenBank:CP044409.1)；SEQ ID NO.6所示的对苯二甲酸分解代谢模块是由来源于丛毛单胞菌(Comamonas sp.)E6的对苯二甲酸分解代谢模块(SEQ ID NO.4)中的转运蛋白模块(SEQ ID NO.5(protein_id＝"BAE47084.1"))替换成来源于阴城假单胞菌GO16的转运蛋白模块(SEQ ID NO.3)得来；SEQ ID NO.4所示的对苯二甲酸分解代谢模块来源于丛毛单胞菌(Comamonas sp.)E6(GenBank:AB238679.1)；SEQ ID NO.3所示
的对苯二甲酸转运模块来源于阴城假单胞菌GO16(protein_id＝"QFG29484.1")。上述菌株为已公开菌株，且对苯二甲酸分解代谢模块和对苯二甲酸转运模块均可通过生物合成获得。
[0014]对苯二甲酸分解代谢模块，是由多个基因组成的对苯二甲酸分解代谢基因簇，包含了转录因子，转运蛋白，环羟基化1，2
‑
双加氧酶和二氢二醇脱氢酶；对苯二甲酸转运模块为对苯二甲酸转运蛋白。
[0015]所述恶臭假单胞菌的株型为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440 ATCC NO.4705；可购买于ATCC生物资源中心。
[0016]作为优选，所述对苯二甲酸分解代谢模块和对苯二甲酸转运模块分别插入两不同的重组质粒上，且两重组质粒均满足在恶臭假单胞菌中自我复制并相容。
[0017]作为优选，所述重组质粒的原始表达载体为pSEVA64。
[0018]作为优选，所述乙二醇代谢的关键基因为gclR，碱基序列如SEQ ID NO.1所示。gclR(PP_4283)是一个内源的Gcl途径的转录抑制因子(NCBI Reference Sequence:NC_002947.4)。
[0019]本专利技术公开了一种所述的恶臭假单胞菌工程菌的制备方法，包括：
[0020](1)利用基因敲除技术将恶臭假单胞菌基因组影响乙二醇代谢的关键基因敲除，敲除后，进行实验室适应性进化，得到进化后的工程菌；
[0021](2)将对苯二甲酸分解代谢模块插入至原始表达载体上；或者，将对苯二甲酸分解代谢模块和对苯二甲酸转运模块分别插入至两原始表达载体上，得到重组质粒；
[0022](3)将重组质粒转化至敲除基因后的工程菌中，得到恶臭假单胞菌工程菌。
[0023]步骤(1)中，基因敲除技术可以是CRISPR/Cas 9，通过敲除关键基因gclR，可以获得以EG为唯一碳源的恶臭假单胞菌。
[0024]进一步地，所述实验室适应性进化的方法包括如下步骤：
[0025](A)挑取LB固体培养基中的恶臭假单胞菌单菌落，接种至液体LB培养基中进行培养，置于摇床上，在30℃条件下，以220r/min的转速培养12
‑
16h，得到种子液体培养物；
[0026](B)将步骤(1)得到的种子液体培养物按照2v/v％的接种量接种在进化培养基中进行培养，置于摇床上，在30℃条件下，以220r/min的转速培养至细胞OD达0.4～0.8，得第一代细胞培养物；
[0027](C)将步骤(2)所得的第一代细胞培养物转接至新鲜进化培养基中，置于摇床上，在30℃条件下，以220r/min的转速培养至细胞OD达0.4～0.8，得到所述菌株的第二代细胞培养物；
[0028](D)不断重复步骤(3)，得到第10～20代细胞培养物；
[0029](E)当细胞生长周期稳定，停止传代，得到进化后的工程菌。
[0030]进一步地，步骤(A)中，所述液体LB培养基的配方为：1L蒸馏水中含：10g蛋白胨、5g酵母粉、10g NaCl，50mg庆大霉素；LB液体培养基需额外添加终浓度为15
‑
20g/L的琼脂粉。
[0031]进一步地，步骤(B)和(C)中，所述进化培养基(MSM培养基)的配方为：1L蒸馏水中含：3.88g K2HPO4，2.12g NaH2PO4·
2H2O，2.00g(NH4)2SO4，0.1g MgCl2·
6H2O，10mg EDTA，2mg ZnSO4·
7H2O，1mg CaCl2·
2H2O，5mg FeSO4·
7H2O，0.2mg Na2MoO4·
2H2O，0.2mg CuSO4·
5H2O，0.4mg CoCl2·
6H2O。
[0032]进一步地，所述步骤(D)中细胞传代次数为10～15。
[0033]本专利技术还提供了所述的恶臭假单胞菌工程菌在高效共利用乙二醇和对苯二甲本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种恶臭假单胞菌工程菌，其特征在于，包括恶臭假单胞菌和导入恶臭假单胞菌满足自我复制的重组质粒；所述恶臭假单胞菌的基因组中敲除了影响乙二醇代谢的关键基因；所述重组质粒为以下之一：(1)包含如SEQ ID NO.2所示的对苯二甲酸分解代谢模块；(2)包含如SEQ ID NO.6所示的对苯二甲酸分解代谢模块；(3)包含如SEQ ID NO.4所示的对苯二甲酸分解代谢模块和如SEQ ID NO.3所示的对苯二甲酸转运模块。2.如权利要求1所述的恶臭假单胞菌工程菌，其特征在于，所述恶臭假单胞菌的株型为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440 ATCC NO.4705。3.如权利要求1所述的恶臭假单胞菌工程菌，其特征在于，对于(3)，所述对苯二甲酸分解代谢模块和对苯二甲酸转运模块分别插入至两不同的重组质粒上，且两重组质粒均满足在恶臭假单胞菌中自我复制并相容。4.如权利要求1所述的恶臭假单胞菌工程菌，其特征在于，所述重组质粒的原始表达载体为pSEVA64。5.如权利要求1所述的恶臭假单胞菌工程菌，其特征在于，所述乙二醇代谢的关键基因为gclR，碱基序列如SEQ ID NO.1所示。6.一种如权利要求1～5任一项所述的恶臭假单胞菌工程菌的制备方法，其特征在于，包括：(1)利用基因敲除技术将恶臭假单胞菌基因组影响乙二醇代谢的关键基因敲除，敲除后，进行实验室适应性进化，得到进化后的工程菌；(2)将对苯二甲酸分解代谢模块插入至原始表达载体上；或者，将对苯二甲酸分解代谢模块和对苯二甲酸转运模块分别插入至两原始表达载体上，得到重组质粒；(3)将重组质粒转化至敲除基因后的工程菌中，得到恶臭假单胞菌工程菌。7.如权利要求6所...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴坚平，梁天鑫，黄磊，张红玉，杨立荣，
申请(专利权)人：浙江大学杭州国际科创中心，
类型：发明
国别省市：
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