一种糖基转移酶融合酶变体及其在AA-2G制备中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种糖基转移酶融合酶变体及其在AA

【技术实现步骤摘要】
一种糖基转移酶融合酶变体及其在AA
‑
2G制备中的应用


[0001]本专利技术涉及一种糖基转移酶融合酶变体及其在AA
‑
2G制备中的应用，属于酶工程


技术介绍

[0002]目前L
‑
抗坏血酸
‑2‑
葡萄苷(AA
‑
2G)生产几乎都是采用酶催化，所用的酶主要是环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)和蔗糖磷酸化酶，前者所用糖基供体主要有液化淀粉、麦芽糊精、环糊精等，后者所用供体为蔗糖，糖基受体均为维生素C。与蔗糖磷酸化酶不同的是，采用环糊精葡萄糖基转移酶催化生产AA
‑
2G通常以β
‑
环糊精、液化淀粉或麦芽糊精为糖基供体，以维生素C为受体，在一定的温度和pH条件下进行反应，此时反应过程中会有大量的AA
‑
2Gn以及AA
‑
2G，需要在催化结束后通过加入糖化酶进一步糖化处理，将AA
‑
2Gn上多余的糖基切除得到AA
‑
2G，完成催化反应。
[0003]然而现有技术中的CGTase催化效率较低，AA
‑
2G酶催化制备周期普遍较长(需要24～72h)，此外，反应还存在严重的平衡问题，AA
‑
2G收率最高仅能达到40
‑
60％左右。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了一种环糊精葡萄糖基转移酶融合酶，含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
[0005]本专利技术还提供了环糊精葡萄糖基转移酶融合酶突变体，是在SEQ ID NO.1所示的融合酶的基础上，将第46位亮氨酸、第152位酪氨酸、第190位甘氨酸、第269位天冬酰胺、第325位异亮氨酸中第一个或多个位点进行了突变。
[0006]在一种实施方式中，所述突变体是将第46位亮氨酸突变为苯丙氨酸，获得突变体L46F。
[0007]在一种实施方式中，所述突变体是将第152位酪氨酸突变为甘氨酸，获得突变体Y152G。
[0008]在一种实施方式中，所述突变体是将第190位甘氨酸突变为色氨酸，获得突变体G190W。
[0009]在一种实施方式中，所述突变体是将第269位天冬酰胺突变为丙氨酸，获得突变体N269A。
[0010]在一种实施方式中，所述突变体是将第325位异亮氨酸突变为赖氨酸，获得突变体I325K。
[0011]在一种实施方式中，所述突变体是将第46位亮氨酸突变为苯丙氨酸，并将第152位酪氨酸突变为甘氨酸，并将第269位天冬酰胺突变为丙氨酸，并将第325位异亮氨酸突变为赖氨酸，获得突变体L46F/Y152G/N269A/I325K。
[0012]在一种实施方式中，所述突变体是将第46位亮氨酸突变为苯丙氨酸，并将第190位甘氨酸突变为色氨酸，并将第325位异亮氨酸突变为赖氨酸，获得突变体L46F/G190W/
I325K。
[0013]在一种实施方式中，所述突变体是将第46位亮氨酸突变为苯丙氨酸，并将第152位酪氨酸突变为甘氨酸，并将第325位异亮氨酸突变为赖氨酸，获得突变体L46F/Y152G/I325K。
[0014]本专利技术还提供了编码所述融合酶或所述融合酶突变体的基因。
[0015]在一种实施方式中，编码所述融合酶的基因含有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
[0016]本专利技术还提供了携带所述基因的重组质粒。
[0017]在一种实施方式中，所述质粒包括但不限于pET系列质粒。
[0018]本专利技术还提供了表达所述融合酶或融合酶突变体的重组微生物细胞。
[0019]在一种实施方式中，所述微生物包括但不限于大肠杆菌。
[0020]在一种实施方式中，所述微生物细胞是以大肠杆菌为宿主，以pET
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28a(+)为表达载体，表达所述突变体。
[0021]本专利技术还提供含有所述微生物细胞的细胞催化剂。
[0022]在一种实施方式中，所述细胞催化剂是将所述重组微生物细胞在培养基中培养一段时间，收集具有环糊精葡萄糖基转移酶活性的细胞培养液。
[0023]在一种实施方式中，所述细胞催化剂按如下方法制备：将所述重组微生物在培养基中培养至菌液OD达到0.6～0.8，加入IPTG诱导酶的表达，诱导一段时间后收集菌体，得到细胞催化剂。
[0024]在一种实施方式中，所述培养基为LB培养基或TB培养基。
[0025]在一种实施方式中，所述诱导剂的添加量为0.05～0.15mmol/L。
[0026]在一种实施方式中，所述诱导是在20～25℃诱导20～28h。
[0027]本专利技术还提供所述突变体或所述细胞催化剂在催化生产L
‑
抗坏血酸
‑2‑
葡萄苷中的应用。
[0028]在一种实施方式中，所述应用是将所述突变体或所述细胞催化剂在含β
‑
环糊精和L
‑
抗坏血酸的反应体系中催化合成L
‑
抗坏血酸
‑2‑
葡萄苷。
[0029]在一种实施方式中，所述应用是以β
‑
环糊精为糖基供体，以抗坏血酸为受体，以所述环糊精葡萄糖基转移酶融合酶或所述环糊精葡萄糖基转移酶融合酶突变体或所述细胞催化剂催化反应3～10h，再加入糖化酶反应至少4h。
[0030]在一种实施方式中，所述应用是以β
‑
环糊精为糖基供体，以抗坏血酸为受体，先采用细胞催化剂在25～30℃反应3～10小时，再升温至50℃并使用糖化酶反应至少4小时。
[0031]在一种实施方式中，所述β
‑
环糊精和抗坏血酸的质量比为1：0.8～1.2。
[0032]有益效果：
[0033]1、本专利技术通过将CGTase
‑
Tx的前1
‑
331段氨基酸和CGTase
‑
Bs的后327
‑
681段氨基酸融合，得到CGTase
‑
TB变体，催化效率较CGTase
‑
Tx进一步提高，AA
‑
2G收率更高，且无副产物产生。
[0034]2、本专利技术对融合突变体CGTase
‑
TB进行了进一步突变，使突变体的催化活性较之其亲本进一步提升，AA
‑
2G收率进一步提升至70％以上，比活力达9.21～19.53U/mg；且突变体的热稳定性相对亲本明显提高，在70℃处理4小时，酶的活性仍有90％残留。
附图说明
[0035]图1为CGTase催化生产AA
‑
2G示意图。
具体实施方式
[0036]下面结合具体实施例，进一步阐明本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。
[0037]实施例涉本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.环糊精葡萄糖基转移酶融合酶，其特征在于，含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。2.环糊精葡萄糖基转移酶融合酶突变体，其特征在于，在SEQ ID NO.1所示的融合酶的基础上，将第46位亮氨酸、第152位酪氨酸、第190位甘氨酸、第269位天冬酰胺、第325位异亮氨酸中第一个或多个位点进行了突变。3.根据权利要求2所述的环糊精葡萄糖基转移酶融合酶突变体，其特征在于，在SEQ IDNO.1所示的融合酶的基础上，将第46位亮氨酸突变为苯丙氨酸，并将第152位酪氨酸突变为甘氨酸，并将第325位异亮氨酸突变为赖氨酸；或将第46位亮氨酸突变为苯丙氨酸，并将第190位甘氨酸突变为色氨酸，并将第325位异亮氨酸突变为赖氨酸；或将第46位亮氨酸突变为苯丙氨酸，并将第152位酪氨酸突变为甘氨酸，并将第269位天冬酰胺突变为丙氨酸，并将第325位异亮氨酸突变为赖氨酸。4.编码权利要求1所述融合酶或权利要求2～3任一所述融合酶突变体的基因。5.携带权利要求4所述基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：程磊雨，彭晨，童涛，张宇，王浩，王福祥，
申请(专利权)人：浙江新和成股份有限公司，
类型：发明
国别省市：