甘草氧甲基转移酶及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术和酶学领域，具体涉及甘草氧甲基转移酶及其应用。本发明专利技术首次公开了甘草氧甲基转移酶，该甘草氧甲基转移酶可用于催化类黄酮物质的甲基化。用于催化类黄酮物质的甲基化。

【技术实现步骤摘要】
甘草氧甲基转移酶及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程技术和酶学领域，具体涉及甘草氧甲基转移酶及其应用。

技术介绍

[0002]黄酮类化合物是植物中广泛存在的一类次生代谢产物，在植物的生长发育及胁迫抵御方面发挥着重要作用。研究表明，许多黄酮类化合物具有优秀的抗氧化、抗炎、抗肿瘤等活性，因此广泛应用于医疗、化妆品、食品等行业。
[0003]黄酮类化合物可以通过多种修饰反应，引入各种取代基，从而形成功能多样的衍生物。其中，甲基化修饰是最基本，也是最重要的一种。已有文献报道多甲基化修饰可以增加黄酮类化合物的生物活性和生物利用度，如白杨素的甲基化可以提高其在小肠内的抗炎能力，黄芩素的甲基化可以提高其抗癌能力，且抑癌活性随甲基化的程度增加而增加。
[0004]目前多甲基化类黄酮的获取主要依靠植物天然产物分离纯化和化学合成两种方法，但存在生产成本高、产量低且工艺复杂的问题。而使用生物工程技术的酶法合成在生产上具有成本更低、效率更高的优势。
[0005]在植物体内，甲基化修饰是由氧甲基转移酶(O
‑
methyltransferase，OMT)完成的。目前，已报道的植物类黄酮OMT的催化位点主要以单甲基化(3、6、7、8、2'、3'和4'位)和二甲基化(3/5、3/7、6/7、7/3'、7/4'、3'/4'、3'/5'位)为主，极少数类黄酮OMT能催化三个及以上(7/3'/5'、3'/4'/5'、3/5/7/3'、5/6/7/8/3')的位点。据报道，柑橘CitOMT2能催化多种类黄酮的3'/5'位甲基化，以及黄芩素的7位甲基化，但不能连续催化7/3'/5'三甲基化；小麦TaOMT2能连续催化五羟黄酮生成3'/4'/5'三甲基化产物，但对黄酮醇类化合物的催化活性低，且产物未鉴定；柑橘CdOMT5能连续催化槲皮素的3/5/7/3'位四甲基化，是目前唯一报道具有连续催化类黄酮四甲基化活性的OMT；黄芩中PFOMT5可以催化2',5,7,8
‑
tetrahydroxyflavone的8
‑
OH单甲基化、催化木犀草素的3'
‑
OH单甲基化，以及催化黄芩素生成6、7、6/7、5/7甲基化的产物，因此对黄酮的5/6/7/8/3'位均有催化活性，但无法连续催化底物生成多甲基化产物，且未对其它类型的类黄酮底物进行测试。甘草中含有300多种类黄酮，具有多种甲基化位点，说明存在多种具有不同催化特异性的OMT，因此从甘草中鉴定OMT进行氧甲基化类黄酮的酶法合成有着广阔的应用前景。但是尚未发现对具有连续催化黄酮醇类和二氢黄酮醇类化合物3'/4'/5'位三甲基化活性的甘草氧甲基转移酶。

技术实现思路

[0006]本专利技术第一方面的目的，在于提供甘草氧甲基转移酶GiOMT4。
[0007]本专利技术第二方面的目的，在于提供与本专利技术第一方面的甘草氧甲基转移酶相关的生物材料。
[0008]本专利技术第三方面的目的，在于提供本专利技术第一方面的甘草氧甲基转移酶的制备方法。
[0009]本专利技术第四方面的目的，在于提供本专利技术第一方面的甘草氧甲基转移酶和/或本
专利技术第二方面的生物材料和/或本专利技术第三方面的制备方法的应用。
[0010]本专利技术第五方面的目的，在于提供一种方法。
[0011]本专利技术第六方面的目的，在于提供一种产品。
[0012]为了实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案是：
[0013]本专利技术的第一个方面，提供甘草氧甲基转移酶GiOMT4，其氨基酸序列包含a1)～a3)中任一种：
[0014]a1)SEQ ID NO.1；
[0015]a2)将SEQ ID NO.1经过一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.1所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
[0016]a3)与SEQ ID NO.1具有99％或98％的同源性且与SEQ ID NO.1所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。
[0017]所述甘草氧甲基转移酶GiOMT4来源于
‘
Gjj9
’
品种的胀果甘草，在甘草中首次发现，属于I类氧甲基转移酶。
[0018]本专利技术的第二个方面，提供与本专利技术第一个方面的甘草氧甲基转移酶相关的生物材料，所述生物材料为b1)～b8)中任一种：
[0019]b1)编码本专利技术第一方面的甘草氧甲基转移酶的核酸分子；
[0020]b2)包含b1)所述核酸分子的表达盒；
[0021]b3)包含b1)所述核酸分子的载体；
[0022]b4)包含b2)所述表达盒的载体；
[0023]b5)包含b1)所述核酸分子的转基因细胞系；
[0024]b6)包含b2)所述表达盒的转基因细胞系；
[0025]b7)包含b3)所述载体的转基因细胞系；
[0026]b8)包含b4)所述载体的转基因细胞系。
[0027]优选地，所述转基因细胞系不包含繁殖材料。
[0028]优选地，所述载体为pColdII。
[0029]优选地，所述转基因细胞为大肠杆菌细胞BL21(DE3)。
[0030]优选地，所述核酸分子的序列包含a1)～a3)中任一种：
[0031]a1)SEQ ID NO.2；
[0032]a2)将SEQ ID NO.2经过一个或多个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.2所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；
[0033]a3)与SEQ ID NO.2具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与SEQ ID NO.2所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列。
[0034]本专利技术的第三个方面，提供本专利技术第一个方面的甘草氧甲基转移酶的制备方法，通过培养本专利技术第二个方面中所述的转基因细胞系表达所述甘草氧甲基转移酶。
[0035]优选地，所述转基因细胞系为将pColdII
‑
GiOMT4导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的表达氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白的转基因细胞系，所述pColdII
‑
GiOMT4为将载体pColdII的KpnI和SalI位点之间的序列替换为SEQ ID No.2所示的DNA片段得到的重组载体。
[0036]优选地，所述表达为诱导表达。
[0037]优选地，所述诱导表达通过IPTG诱导。
[0038]本专利技术的第四个方面，提供本专利技术第一个方面的甘草氧甲基转移酶和/或本专利技术第二个方面的生物材料和/或本专利技术第三个方面的制备方法的应用。
[0039]c1)～c3)中至少一种在d1)～d13)中至少一种中的应用；
[0040]c1)本专利技术第一个方面的甘草氧甲基转移酶；
[0041]c2)本专利技术第二个方面的生物材料；
[0042]c3)本专利技术第三个方面的制备方法；
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.甘草氧甲基转移酶，所述甘草氧甲基转移酶的氨基酸序列包含a1)～a3)中任一种：a1)SEQ ID NO.1；a2)将SEQ ID NO.1经过一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.1所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；a3)与SEQ ID NO.1具有99％或98％的同源性且与SEQ ID NO.1所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。2.与权利要求1所述的甘草氧甲基转移酶相关的生物材料，所述生物材料为b1)～b8)中任一种：b1)编码权利要求1所述的甘草氧甲基转移酶的核酸分子；b2)包含b1)所述核酸分子的表达盒；b3)包含b1)所述核酸分子的载体；b4)包含b2)所述表达盒的载体；b5)包含b1)所述核酸分子的转基因细胞系；b6)包含b2)所述表达盒的转基因细胞系；b7)包含b3)所述载体的转基因细胞系；b8)包含b4)所述载体的转基因细胞系。3.权利要求1所述的甘草氧甲基转移酶的制备方法，通过培养权利要求2中所述的转基因细胞系表达所述甘草氧甲基转移酶。4.c1)～c3)中至少一种在d1)～d13)中至少一种中的应用；c1)权利要求1所述的甘草氧甲基转移酶；c2)权利要求2所述的生物材料；c3)权利要求3所述的制备方法；d1)催化类黄酮物质的甲基化；d2)制备催化类黄酮物质的甲基化的产品；d3)合成物质A；d4)制备合成物质A的产品；d5)合成物质B；d6)制备合成物质B的产品；d8)合成物质C；d9)制备合成物质C的产品；d10)合成物质D；d11)制备合成物质D的产品；d10)合成物质E；d11)制备合成物质E的产品；d12)合成物质F；d13)制备合成物质F的产品；所述物质A包含：异鼠李素、怪柳黄素和五桠果素中的至少一种；所述物质B包含：3'
‑
O
‑
甲基二氢槲皮素、二氢怪柳黄素和3',4'
‑
O
‑
二甲基二氢槲皮素中的至少一种；
所述物质C包含：金圣草黄素、香叶木素和3',4'
‑
O
‑
二甲基木犀草素中的至少一种；所述物质D包含：高圣草酚、橙皮素和3',4'
‑
O
‑
二甲基圣草酚中的至少一种；所述物质E包含：3,3',5,5',7
‑
五羟基
‑
4'
‑
甲氧基黄酮、3,5,5',7
‑
四羟基
‑
3',4'
‑
二甲氧基黄酮、3,4',5,7
‑
四羟基
‑
3',5'
‑
二甲氧基黄酮、3,5,7
‑
三羟基
‑
3',4',5'
‑
三甲氧基黄酮中的至少一种；所述物质F包含：3,3',5,5',7
‑
五羟基
‑
4'
‑
甲氧基二氢黄酮、3,5,5',7
‑
四羟基
‑
3',4'
‑
二甲氧基二氢黄酮、3,4',5,7
‑
四羟基
‑
3',5'
‑
二甲氧基二氢黄酮、3,5,7
‑
三羟基
‑
3',4',5'
‑
三甲氧基二氢黄酮中的至少一种。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述类黄酮物质包含：黄酮醇、二氢黄酮醇、黄酮、二氢黄酮中的至少一种；优选地，所述黄酮醇包含：槲皮素、杨梅素中的至少一种；优选地，所述二氢黄酮醇包含：二氢槲皮素、二氢杨梅素中的至少一种；优选...

【专利技术属性】
技术研发人员：王瑛，李勇青，黄韵，梁晓菊，
申请(专利权)人：中国科学院华南植物园，
类型：发明
国别省市：